САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ И САНИТАРНО-ПАРАЗИТОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВОДЫ ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.1884-04 (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 03.03.2004)


Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
3 марта 2004 года
Дата введения
с момента утверждения
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ И САНИТАРНО-ПАРАЗИТОЛОГИЧЕСКИЙ
АНАЛИЗ ВОДЫ ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.1884-04
1. Разработаны: НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН, ИМПиТМ им. Е.И. Марциновского ММА им. И.М. Сеченова, Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России, НИИ коммунального водоснабжения и очистки воды, НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова, Ростовским-на-Дону НИИ микробиологии и паразитологии Минздрава России, кафедрой паразитологии, паразитарных и тропических болезней МПФ ППО ММА им. И.М. Сеченова, Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана, Центром госсанэпиднадзора в г. Москве, Департаментом госсанэпиднадзора Минздрава России, Курским государственным университетом, Белгород-Днестровским центром госсанэпиднадзора, Тюменским НИИ краевой инфекционной патологии Минздрава России.
Использованы материалы ГУП "Мосводоканал", аналитического Центра "РОСА", Фирмы "Стайлаб", Центра госсанэпиднадзора Краснодарского края, Центра госсанэпиднадзора Тульской области, Московского НИИ генетики.
2. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г. Онищенко 3 марта 2004 г.
3. Введены взамен МУ 2285-81 "Методические указания по санитарно-микробиологическому анализу воды поверхностных водоемов".
1. Область применения
1.1. Настоящие Методические указания по методам контроля (далее - МУК) устанавливают методы санитарно-микробиологического и санитарно-паразитологического контроля качества воды поверхностных водных объектов в пунктах питьевого, хозяйственно-бытового и рекреационного водопользования, а также у населенных мест в соответствии с СанПиН 2.1.5.980-00 "Гигиенические требования к охране поверхностных вод", СанПиН 2.1.4.1074-01 "Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества".
1.2. Методические указания предназначены для органов и учреждений государственной санитарно-эпидемиологической службы, обеспечивающих государственный санитарно-эпидемиологический надзор и контроль за качеством воды поверхностных водоемов, используемых или намечаемых к использованию в качестве источников централизованного водоснабжения, зон рекреации, а также могут быть использованы лабораториями организаций, осуществляющих производственный контроль.
1.3. Санитарно-микробиологический анализ воды подземных источников проводят в соответствии с МУК 4.2.1018-01 "Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды".
1.4. Санитарно-микробиологический анализ воды действующих источников в черте населенных мест, зонах рекреации осуществляют по показателям СанПиН 2.1.5.980-00 "Гигиенические требования к охране поверхностных вод": общие и термотолерантные колиформные бактерии, колифаги, возбудители кишечных инфекций (сальмонеллы, энтеровирусы).
1.5. При выборе нового поверхностного источника централизованного питьевого водоснабжения, а также при решении вопроса о необходимости проведения оздоровительных мероприятий или закрытия зоны рекреации анализ качества воды проводят по более широкому набору микробиологических показателей в соответствии с действующими документами. Методы определения дополнительных показателей приведены в Приложениях 1 - 10.
2. Санитарно-микробиологические исследования
2.1. Отбор, хранение и транспортирование проб
Отбор проб осуществляют в соответствии с требованиями ГОСТ Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб" и ГОСТ Р 51593-2000 "Вода питьевая. Отбор проб".
Пробы для санитарно-микробиологического анализа отбирают в стерильные емкости.
Для отбора проб воды используют специально предназначенную для этих целей одноразовую посуду или емкости многократного применения, изготовленные из материалов, не влияющих на жизнедеятельность микроорганизмов.
Емкости должны быть оснащены плотно закрывающимися пробками (силиконовыми, резиновыми или из других материалов) и защитным колпачком (из алюминиевой фольги, плотной бумаги) или с завинчивающимися крышками. Многоразовая посуда, в т.ч. пробки, должна выдерживать стерилизацию сухим жаром или автоклавированием.
Стерильные емкости открывают непосредственно перед отбором, удаляя пробку вместе со стерильным колпачком. Во время отбора пробка и края емкости не должны чего-либо касаться. Ополаскивать посуду не следует.
После наполнения емкость закрывают стерильной пробкой, обеспечивающей герметичность и не намокающей при транспортировании (ватные пробки не применять), и стерильным колпачком.
При заполнении емкостей должно оставаться пространство между пробкой и поверхностью воды, чтобы пробка не смачивалась при транспортировке.
Поверхностные пробы отбирают с глубины 10 - 15 см от поверхности воды или от нижней кромки льда. Придонные пробы отбирают в 30 - 50 см от дна. Отбор проб следует производить с использованием различных плавсредств, с мостов, помостов и т.п. в местах, где глубина водоемов не менее 0,5 м. Недопустимо производить отбор проб с берега.
Поверхностные пробы отбирают батометром с устройством для закрепления стерильных емкостей. Глубинные пробы отбирают специальным батометром, предназначенным для этих целей. Допускается использовать другие приспособления, установленные в приложении к ГОСТ Р 51592-2000.
При отборе одним батометром нескольких проб его каждый раз стерилизуют фламбированием. Из одной точки в первую очередь отбирают пробы для микробиологических исследований, а затем для других целей. Проруби делают, избегая внесения загрязнения со льда и инструментов. Руки перед отбором проб должны быть обеззаражены.
Для воды, содержащей токсичные металлы (бериллий, ртуть, кадмий, таллий) массовой концентрацией более 0,01 мг/л, в емкости до их стерилизации добавляют 0,3 мл 15%-ного раствора нитрилотриуксусной кислоты на 500 мл пробы.
Отбор проб производит специалист после прохождения инструктажа по технике выполнения отбора проб для микробиологического анализа.
Отобранную пробу маркируют и сопровождают документом отбора проб воды с указанием места, даты, времени забора, фамилии специалиста, отбиравшего пробу, и другой информации (температуры воды, погодных условий).
Объем пробы зависит от того, какие микроорганизмы должны быть определены, например:
- при анализе воды на индикаторные микроорганизмы - не менее 500 мл;
- при анализе воды на индикаторные и патогенные бактерии (сальмонеллы) - 1,5 л.
Доставку проб воды осуществляют в контейнерах-холодильниках при температуре 4 - 10 °C. В холодный период года контейнеры снабжают термоизолирующими прокладками, обеспечивающими предохранение проб от промерзания. В лаборатории, если анализ по каким-либо причинам откладывают, пробы следует поместить в холодильник.
При соблюдении указанной температуры транспортирования и хранения срок начала исследований от момента отбора проб не должен превышать 6 часов. Если пробы нельзя охладить, их анализ проводят в течение 2 часов после забора.
Если не может быть соблюдено время доставки пробы и температура хранения, анализ пробы по бактериологическим показателям не проводят.
Метод отбора и концентрирования кишечных вирусов из воды поверхностных водоемов представлен в п. 2.11.
2.2. Аппаратура, расходные материалы, реактивы,
питательные среды
2.2.1. Аппаратура
Термостаты для температурного режима (37 +/- 1) °C
Термостат и водяная баня с автоматическим
регулированием температуры (44 +/- 0,5) °C
Водяная баня для температурного режима
(75 +/- 5) °C
Водяная баня или термостат для температурного
режима 45 - 49 °C (для питательных сред)
Прибор для мембранной фильтрации под вакуумом
с диаметром фильтрующей поверхности 35 или 47 мм и
устройство для создания разрежения 0,5 - 1,0 атм.
Весы лабораторные общего назначения 4 класса
точности, с пределом взвешивания до 1000 г,
допустимая погрешность не более 0,1 г ГОСТ 24104-80
Весы лабораторные общего назначения 4 класса
точности, с пределом взвешивания до 200 г,
допустимая погрешность не более 0,02 г ГОСТ 24104-80
Весы торсионные с диапазоном измерений
от 0 до 500 мг
Термометр ртутный с диапазоном измерения от 0 до
50 °C с ценой деления шкалы 0,5 °C
Термометр ртутный с диапазоном измерения от 0 до
200 °C с ценой деления шкалы 1 °C
Термометр спиртовой с диапазоном измерения от -50
до +50 °C с ценой деления шкалы 1 °C
pH-метр, обеспечивающий измерение с погрешностью
до 0,01 ГОСТ 15150-69
Дистиллятор, обеспечивающий качество
дистиллированной воды не ниже ГОСТ 6709-72
Стерилизатор суховоздушный для температурного
режима (180 +/- 5) °C
Стерилизатор паровой, режим работы от 0 до
2,5 кгс/куб. см ГОСТ 17726-81
Холодильники бытовые электрические с температурой
в камере 4 - 6 °C
Холодильник глубокого замораживания (-20 °C) <*>
Вытяжной шкаф для работы с хлороформом
при исследованиях на колифаги <*>
Нагревательный прибор для варки питательных сред
либо магнитные мешалки с подогревом до 300 °C
Прибор для счета колоний бактерий
Лупа с двукратным увеличением
Дозаторы для разлива жидких питательных сред и
растворов
Дозаторы пипеточные
Облучатель бактерицидный
Оптический стандарт мутности на 10 ед.
Микроскоп стереоскопический, обеспечивающий
увеличение от 3,5х до 119х, с полем зрения
39 - 1,9 мм
Инвертированный микроскоп для просмотра флаконов
с культурами клеток при анализе на энтеровирусы <*>
Микроскоп биологический, обеспечивающий
увеличение от 84х до 1350х ГОСТ 8284-78
Батометр с устройством для закрепления стерильных
емкостей
Батометр специальный для отбора проб с разных
глубин
Часы сигнальные или песочные ГОСТ 10576-74
Центрифуга лабораторная рефрижераторная ЦЛР-1МР <*> ТУ-42-2145
Шуттель-аппарат <*>
Ламинарный шкаф для культуры клеток (класс
не ниже 2) <*>
Микродозаторы переменного объема: на 0,5 - 10 мкл;
40 - 200 мкл; 200 - 1000 мкл
Штатив для микродозаторов 5-поз.
Наконечники на 200, 1000 мкл
------------------------------------
<*> Аппаратура, используемая для вирусологического анализа.
Примечание. Для экспресс-анализа индикаторных и патогенных микроорганизмов в воде может использоваться микробиологический анализатор "БакТрак 4000" в соответствии с МУК 4.2.1111-02.
2.2.2. Посуда лабораторная стеклянная
Пробирки (многоразового или одноразового ГОСТ 25336-82
использования)
Цилиндры вместимостью 100, 250, 500 мл
или мензурки вместимостью 250, 500, 1000 мл ГОСТ 1770-74
Чашки бактериологические (Петри) ГОСТ 23932-90
Воронки стеклянные ГОСТ 25336-82
Пипетки вместимостью 1, 2, 5, 10 мл с ценой
деления 0,1 мл (многоразового или одноразового
использования) ГОСТ 29227-91
Стекла предметные ГОСТ 9284-85
Стекла покровные ГОСТ 6672-85
Стеклянные бюретки диаметром 12 - 13 мм
и высотой 35 - 40 см
Флаконы стеклянные или пластиковые (одноразовые)
для культивирования культур тканей емкостью:
5, 100, 200, 500 и 1000 мл
2.2.3. Расходные материалы
Мембранные фильтры для микробиологических целей
с диаметром пор не более 0,45 мкм и размером диска
35 или 47 мм или другие фильтрующие мембраны
с аналогичной способностью фильтрации, имеющие
сертификат качества
Индикаторы бумажные для определения рН в
диапазоне 6 - 8 с интервалом определения 0,2
Фольга алюминиевая, колпачки металлические
Горелки газовые или спиртовки
Петли бактериологические
Поплавки бактериологические
Пинцеты для работы с мембранными фильтрами
Штативы для пробирок
Емкости эмалированные
Пробки различных размеров: силиконовые, резиновые
и другие, выдерживающие стерилизацию сухим жаром
или автоклавированием ГОСТ 12026-76
Вата хлопковая медицинская гигроскопическая ГОСТ 5556-81
Марля медицинская ГОСТ 9412-77
Маркеры водостойкие
Лейкопластырь
Перчатки резиновые
Шпагат
Бумага плотная для упаковки посуды
Штативы комбинированные для пробирок 0,6 и 1,5 мл
Пленка Parafilm M
Штативы для культивирования клеток культур ткани
в пробирках в статическом состоянии
Планшеты пластиковые для культивирования культур
тканей
2.2.4. Химические реактивы
Железо серно-кислое закисное 7-водное ГОСТ 4148-78
Бромтимоловый синий ТУ 6-09-20-86-77
Кислота соляная ГОСТ 3118-77
Натрий серноватисто-кислый (тиосульфат натрия)
5-водный ГОСТ 27068-86
Натрий хлористый ГОСТ 4233-77
Натрий гидрат окиси ГОСТ 4328-77
Спирт этиловый ректификованный медицинский ГОСТ 5962-67
Спирт этиловый технический ГОСТ 18300-87
Глюкоза ГОСТ 6038-79
Лактоза ГОСТ 6038-74
Натрий сернисто-кислый (сульфит натрия) ГОСТ 903-76
альфа-нафтол <**> ГОСТ 5838-79
Розоловая кислота
Фенилендиаминовые соединения <**>:
N,N,N",N"-тетраметил-п-фенилендиамин гидрохлорид
или N,N-диметил-п-фенилендиамин соляно-кислый ТУ 6-09-1903-77
Фуксин основной <**> ТУ 6-09-4119-75
Хлороформ <***> ГОСТ 22300
Калий фосфорно-кислый однозамещенный ГОСТ 4198-75
Калий фосфорно-кислый двузамещенный ГОСТ 2493-75
Кислота серная ГОСТ 4204-77
Натрий двууглекислый ГОСТ 2156-76
Натрий углекислый ГОСТ 83-79
Натрий фосфорно-кислый двузамещенный безводный ГОСТ 11773-76
Натрий фосфорно-кислый однозамещенный ГОСТ 245-76
Фенол ГОСТ 5417-72
Бриллиантовый зеленый ТУ 6-09-4278-76
Калий теллуристо-кислый ТУ 6-09-2060-77
Кислота ортофосфорная ТУ 6-09-4229-76
Магний хлористый 6-водный ГОСТ 4209-77
Натрия азид
Перекись водорода 33% ГОСТ 10929-76
Парадиметиламинобензальдегид ТУ 6-09-3272-77
2,3,5-трифенилтетразолий хлорид ТУ 6-09-3838-78
Кальций углекислый
Йод кристаллический
Калий йодистый
Триптофан
Амиловый спирт
Фуксин кислый
Тетратионат калия
Кристаллический фиолетовый водорастворимый
Трис (Tris (hydroxymethyl)aminomethone)М.
в 121, Sigma T 1378 <*>
Бифэкстракт (сухой) Sigma B-4888 <*>
Макропористое стекло - МПС 1000 ВГХ
Нейтральный красный <*>
------------------------------------
<*> Вещества, используемые для вирусологического анализа.
<**> Вещества обладают канцерогенным и мутагенным действием, работа с ними требует соблюдения мер предосторожности.
<***> Вещества, используемые для исследований на колифаги и энтеровирусы.
Примечание. Все химические реактивы должны соответствовать квалификации не ниже ЧДА.
2.2.5. Питательные среды
Питательная среда для выделения энтеробактерий,
сухая (типа Эндо)
Агар микробиологический ГОСТ 17206-84
Агар питательный, сухой ТУ 42-14-33-75
Сухой препарат с индикатором ВР и лактозой
или среда Гисса с лактозой
Сухой препарат с индикатором ВР и глюкозой
или среда Гисса с глюкозой
Сухой питательный бульон
Пептон сухой ферментативный для
бактериологических целей ГОСТ 13805-76
Системы индикаторные бумажные (СИБ)
- СИБ-лактоза
- СИБ-оксидаза
- СИБ-глюкоза
Питательная среда для накопления сальмонелл,
сухая (селенитовый бульон)
Питательная среда для выделения энтерококков,
сухая
Питательная среда для выделения стафилококков,
сухая
Агар с эозин-метиленовым синим, сухой
(среда Левина)
Висмут-сульфит агар
SS-агар
Питательная среда для первичной идентификации
энтеробактерий (агар Клиглера)
Сыворотки агглютинирующие адсорбированные
сальмонеллезные О и Н (сухие)
Сыворотки агглютинирующие адсорбированные
поливалентные к сальмонеллам
Яйца куриные диетические
Молоко обезжиренное
Антибиотики: бензилпенициллин натриевая соль,
сульфат стрептомицина <*>
Раствор Эрла 10-кратный 5860-68 <*>
Раствор Версена <*>
Раствор Хенкса, рН 7,2 <*>
Среда Игла-МЭМ с двойным набором аминокислот <*>
Сыворотка эмбриональная <*>
Раствор трипсина 0,25% <*>
Перевиваемые линии клеток RD, ВGМ, Hep-2 <*>
Набор диагностических сывороток для типирования
вирусов <*>
------------------------------------
<*> Реактивы и питательные среды для вирусологического анализа.
Допускаются к использованию оборудование, расходные материалы, реактивы, питательные среды, диагностические препараты и системы идентификации с аналогичными характеристиками, разрешенные к применению для этих целей в установленном порядке.
Питательные среды и биологические препараты зарубежного производства должны иметь международный сертификат качества ISO 9000 или ЕN 29000.
При использовании следует руководствоваться рекомендациями фирмы-производителя.
Все обезвоженные питательные среды должны иметь сертификат соответствия.
2.2.6. Тест-культуры микроорганизмов
Контрольный колифаг МS-2 штамм ВКПМ РН 1505, штамм ВКПМ-3254
+
Е.соli К F Str-r, штамм Еscherichia coli 675, Staphylococcus
12
aureus 906 и один из штаммов: Pseudomonas aeruginosa 10145 АТСС
или Pseudomonas fluorescens 948 АТСС.
Штаммы получают во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (Государственном НИИ генетики) и (или) в Национальном органе контроля (Государственном НИИ стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича).
Примечание. В производственных лабораториях, расположенных на территории водопроводных станций, следует использовать штамм Pseudomonas fluorescens (температура инкубации культуры 25 - 28 °C).
2.2.7. Внутренний контроль качества микробиологических
исследований
Комплекс выполняемых лабораторией мероприятий и процедур, направленных на обеспечение и контроль стабильности требуемых условий роста микроорганизмов, ведения эталонных бактериальных культур, а также предупреждения неблагоприятного воздействия факторов, возникающих в процессе выполнения анализа и оценки его результатов, изложены в МУ 2.1.4.1057-01 "Организация внутреннего контроля качества санитарно-микробиологического исследования воды".
2.3. Подготовка посуды и материалов
Вся посуда, применяемая для микробиологического анализа, должна быть стерильной.
Правила подготовки посуды и материалов - в соответствии с МУК 4.2.1018-01 "Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды".
Срок хранения стерильной посуды не более 30 дней.
Лабораторная посуда для вирусологических исследований должна быть химически чистой, а именно, хорошо обезжирена, тщательно вымыта до полного удаления моющих средств и других посторонних примесей, высушена и простерилизована.
Новая стеклянная посуда должна выдерживаться в течение 2 ч в 15 - 20%-ном растворе серной кислоты (применяется только химически чистая серная кислота) или в течение 10 - 12 ч в 4%-ном растворе соляной кислоты. Работу необходимо проводить с соблюдением правил техники безопасности - в защитных очках, резиновом фартуке и резиновых перчатках. После обработки кислотой посуду тщательно промывают струей горячей воды (не менее 10 раз) и троекратно - дистиллированной водой, высушивают, монтируют в металлические контейнеры или в бумагу.
Посуду для микробиологического анализа стерилизуют в сухожаровом шкафу в течение 2 ч при 180 °C.
Контроль стерильности посуды проводят в соответствии с МУ 2.1.4.1057-01 "Организация внутреннего контроля качества санитарно-микробиологических исследований воды".
2.4. Приготовление питательных сред и реактивов
2.4.1. Общие требования
При выполнении микробиологического анализа следует отдавать предпочтение стандартизованным сухим питательным средам промышленного производства. При использовании промышленных сухих питательных сред их приготавливают в соответствии с указаниями изготовителя на этикетке. В этом случае следует соблюдать способ применения и срок хранения питательных сред, указанных на упаковках.
Общие требования к питательным средам даны в ГОСТ Р 51456-2000.
Вновь приобретенная партия питательных сред должна пройти внутренний контроль качества в соответствии с МУ 2.1.4.1057-01 "Организация внутреннего контроля качества санитарно-микробиологических исследований воды".
По этому же документу выполняют контроль питательных сред на этапе приготовления, контроль условий и сроков хранения готовых питательных сред, контроль их биологических свойств, характеристик роста бактерий и т.п.
Питательные среды, разлитые в чашки и хранящиеся в холодильнике, перед посевом должны быть прогреты до комнатной температуры.
При наличии следов влаги на поверхности агаризованных сред проводят подсушивание в термостате, приоткрывая крышку, до исчезновения конденсата.
2.4.2. Растворы для разбавлений
2.4.2.1. Солевой (физиологический) раствор.
В 1 л дистиллированной воды растворяют 8,5 г хлорида натрия, устанавливают рН с расчетом, чтобы после стерилизации рН = 7,0 +/- 0,1. Разливают во флаконы, стерилизуют при температуре (120 +/- 2) °C 20 мин. Разливают мерно непосредственно перед посевом.
Срок хранения - до 1 месяца при комнатной температуре.
2.4.2.2. Пептонный раствор.
В 1 л дистиллированной воды растворяют при кипячении 1 г пептона. Устанавливают рН с расчетом, чтобы после стерилизации рН = 7,0 +/- 0,1. Разливают во флаконы. Стерилизуют при температуре (120 +/- 2) °C 20 мин. Разливают мерно непосредственно перед посевом.
Срок хранения - до 1 месяца при комнатной температуре.
2.4.2.3. Пептонный солевой раствор.
В 1 л дистиллированной воды растворяют при кипячении 8,5 г хлорида натрия и 1 г пептона. Устанавливают рН с расчетом, чтобы после стерилизации рН = 7,0 +/- 0,1. Стерилизуют при температуре (120 +/- 2) °C 20 мин. Разливают мерно непосредственно перед посевом.
Срок хранения - до 1 месяца при комнатной температуре.
2.4.3. Питательный бульон
Готовят из сухого препарата промышленного производства по способу, указанному на этикетке.
Питательный бульон (десятикратный) для колифагов готовят путем увеличения в 10 раз навески сухого препарата, указанной на этикетке.
2.4.4. Питательный агар
Готовят из сухого препарата промышленного производства по способу, указанному на этикетке.
Питательный агар не допускается выдерживать в расплавленном состоянии более 8 ч. Оставшийся неиспользованным агар повторному расплавлению не подлежит.
Питательный агар для определения колифагов прямым методом при посеве 20 мл пробы на чашку Петри готовят, увеличивая навеску сухого препарата в 2 раза от прописи. Разливают в емкости, автоклавируют при температуре (120 +/- 2) °C 20 мин.
Полужидкий питательный агар готовят с использованием одной трети навески сухого препарата, указанной на этикетке. Разливают в пробирки и автоклавируют при температуре (120 +/- 2) °C 20 мин.
Питательный агар со стрептомицином готовят из расчета содержания 100 мкг стрептомицина на 1 мл питательного агара, приготовленного по стандартной прописи. Стерильно на стерильной дистиллированной воде готовят раствор стрептомицина в концентрации 10 мг на 1 мл. В готовый питательный агар, отмеренный по объему и остуженный до температуры 45 - 49 °C, вносят приготовленный стерильный раствор стрептомицина из расчета 0,1 мл на 10 мл питательного агара. Разливают в пробирки для приготовления скошенного агара. Срок хранения питательного агара со стрептомицином не более 2 недель. Повторное расплавление питательной среды со стрептомицином запрещается.
2.4.5. Фуксин-сульфитная среда Эндо
Готовят из сухого препарата по способу, указанному на этикетке.
Готовую среду охлаждают до 60 - 70 °C и разливают в чашки Петри.
Если после застывания на поверхности среды заметны следы влаги, чашки перед посевом необходимо подсушить. Срок хранения чашек со средой не более 3 - 5 суток в темноте, если производителем не оговорены другие сроки.
Примечание. В соответствии со стандартом ИСО 9308-1-2000 для определения колиформных бактерий методом мембранной фильтрации может использоваться лактозный-ТТХ-тергитол-агар.
2.4.6. Лактозопептонная среда
10 г пептона, 5 г натрия хлористого, 5 г лактозы растворяют при нагревании в 1 л дистиллированной воды. После растворения ингредиентов добавляют индикатор (2 мл 1,6%-ного спиртового раствора бромтимолового синего), устанавливают рН (7,4 - 7,6), разливают по 10 мл в пробирки. Для приготовления концентрированной лактозопептонной среды все ингредиенты, кроме воды, увеличивают в 10 раз, разливают по 1 мл в пробирки и по 10 мл во флаконы.
Готовую среду стерилизуют при (112 +/- 2) °C 12 мин.
2.4.7. Питательные среды для подтверждения способности
ферментировать лактозу до кислоты и газа
2.4.7.1. Полужидкая среда с лактозой из сухого препарата.
Готовят по способу, указанному на этикетке.
Срок хранения не более 2 недель при комнатной температуре. В холодильнике не хранить.
Посев производят уколом до дна пробирки. При образовании кислоты цвет питательной среды изменяется в соответствии с использованным индикатором. При газообразовании газ скапливается или по уколу, или на поверхности, или в толще среды появляются разрывы. При инкубации посевов более 5 ч газ может улетучиться. В таких случаях на присутствие газа указывают оставшиеся в толще среды "карманы" - потемнения среды на месте бывшего пузырька газа.
2.4.7.2. Жидкая лактозопептонная среда.
Готовят в соответствии с п. 2.4.6 с добавлением 1 мл 1,6% спиртового раствора бромтимолового синего на 1 л среды, разливают по 3 - 5 мл в пробирки с поплавком или комочком ваты.
2.4.7.3. СИБ-лактоза.
Готовят по прописи завода-изготовителя.
Примечание. При выборе среды для подтверждения ферментации углеводов целесообразно использовать полужидкие среды, которые позволяют улавливать небольшое количество газа и на ранних стадиях ферментации, что повышает чувствительность метода и скорость получения ответа через 4 - 6 ч.
2.4.8. Приготовление лактозного бульона с борной кислотой
10 г пептона, 12,2 г калия фосфорно-кислого двузамещенного (безводного), 4,1 калия фосфорно-кислого однозамещенного (безводного), 3,2 г борной кислоты, 5 г лактозы растворяют в 1 л дистиллированной воды, разливают по 5 мл в пробирки с поплавками или комочками ваты, стерилизуют при (112 +/- 2) °C 12 мин. Срок хранения не более 2 недель.
Примечание. Каждую новую партию борной кислоты следует испытывать: при выращивании Е.coli при температуре 44 °C среда дает положительную реакцию - помутнение и газ.
2.4.9. Реактивы для оксидазного теста
Вариант 1.
1% водный раствор тетраметил-п-фенилендиамина гидрохлорида. Готовят перед употреблением.
Вариант 2.
Реактив N 1. 1% спиртовой раствор альфа-нафтола.
Реактив N 2. 1% водный раствор диметил-п-фенилендиамина дигидрохлорида.
Растворы сохраняют в темных флаконах с притертыми пробками: 1-й - до одного месяца, 2-й - до одной недели. Перед употреблением к трем частям первого раствора добавляют семь частей второго раствора.
Могут быть использованы коммерческие тест-системы для постановки оксидазного теста (СИБ-оксидаза или аналоги). Каждую новую партию и периодически раз в месяц реактивы или тест-системы на оксидазу следует испытывать с тест-культурами микроорганизмов, дающих положительную (Рs.aeruginosa, Рs.fluorescens) и отрицательную (Е.coli) оксидазную реакцию.
2.4.10. Железосульфитный агар
В 1000 мл стерильного расплавленного питательного агара (по п. 2.4.4) добавляют 10 г глюкозы, нагревают до растворения, разливают мерно во флаконы, автоклавируют при (112 +/- 2) °C 12 мин. (основная среда).
20%-ный раствор сульфита натрия (Na2SO3) и 8%-ный раствор железа серно-кислого закисного (FeSO4) или железа хлористого (FeCl2) готовят непосредственно перед употреблением в стерильной посуде на стерильной дистиллированной воде. Раствор сульфита натрия нагревают до полного растворения. Перед выполнением анализа в 100 мл расплавленной основной среды вносят 5 мл 20%-ного раствора сульфита натрия, перемешивают, затем вносят 1 мл 8%-ного раствора серно-кислого железа, перемешивают и стерильно разливают во флаконы.
2.4.11. Щелочно-полимиксиновая среда (ЩЕС)
------------------------------T----------------T-----------------¬
¦ Ингредиенты ¦ Обычная ¦ Удвоенная ¦
¦ ¦ концентрация ¦ концентрация ¦
+-----------------------------+----------------+-----------------+
¦1. Мясопептонный бульон ¦70,0 мл ¦70,0 мл ¦
+-----------------------------+----------------+-----------------+
¦Натрий хлористый ¦0,5 г ¦1,0 г ¦
+-----------------------------+----------------+-----------------+
¦Глюкоза ¦1,0 г ¦2,0 г ¦
+-----------------------------+----------------+-----------------+
¦Дрожжевой экстракт ¦2,0 мл (или 2 г)¦4,0 мл (или 4 г) ¦
+-----------------------------+----------------+-----------------+
¦2. Вода дистиллированная ¦15,0 мл ¦15,0 мл ¦
+-----------------------------+----------------+-----------------+
¦Натрий углекислый ¦0,53 г ¦1,1 г ¦
+-----------------------------+----------------+-----------------+
¦3. Вода дистиллированная ¦10,0 мл ¦10,0 мл ¦
+-----------------------------+----------------+-----------------+
¦Натрий двууглекислый ¦0,25 г ¦0,5 г ¦
L-----------------------------+----------------+------------------
Растворы 1, 2 и 3 стерилизуют раздельно при 112 °C 12 мин. После стерилизации растворы смешивают, проверяют рН (10,0 - 10,2), прибавляют 20000 единиц полимиксина М, 0,5 мл 1,6%-ного спиртового раствора бромтимолового синего, разливают в пробирки по 5 мл. В среду удвоенной концентрации добавляют 40000 единиц полимиксина М и 1 мл бромтимолового синего. Разливают в колбы или флаконы по 10, 50 и 100 мл соответственно количеству исследуемой воды.
2.4.12. Приготовление молочно-ингибиторной среды
85 мл готового питательного агара, 15 мл стерильного обезжиренного (0,5% жирности) молока, 1,25 мл 0,01%-ного водного раствора кристаллического фиолетового, 1 мл 2%-ного водного раствора теллурита калия. Хорошо смешивают и разливают в чашки Петри.
2.4.13. Приготовление дрожжевого экстракта
1000 г прессованных (пекарских) дрожжей распределяют равномерно в 2000 мл дистиллированной воды, прогревают в автоклаве при 100 °C 30 мин., отстаивают в холодильнике 4 - 5 суток. Надосадочную жидкость разливают во флаконы по 50 - 100 мл, прибавляют на каждые 100 мл экстракта 1,25 мл 0,01%-ного водного раствора кристаллического фиолетового, вновь прогревают при 100 °C 30 мин. Хранят экстракт в холодильнике. Экстракт можно готовить по этой же методике из 1000 г сухих дрожжей на 6000 мл дистиллированной воды. Можно применять сухой дрожжевой экстракт промышленного производства, уменьшив концентрацию в 10 раз от указанного в прописи п. 2.4.11.
2.4.14. Азидная среда Сланеца - Бертли
Сухой питательный агар промышленного производства по указанию на этикетке, калий фосфорно-кислый однозамещенный 4 г расплавляют при нагревании в 1000 мл дистиллированной воды, устанавливают рН 7,0, разливают мерно в емкости, стерилизуют при (120 +/- 2) °C 20 мин.
Перед употреблением в расплавленный и слегка остуженный агар добавляют из расчета на 100 мл среды: дрожжевого экстракта - 2 мл, глюкозы - 1,0 г, азида натрия - 0,04 г, 1%-ного водного раствора 2,-3,-5-трифенилтетразолий хлорида (ТТХ) - 1 мл. Тщательно смешивают, разливают в чашки по 20 - 25 мл. Хранят в холодильнике не более 2 недель. Среду можно готовить перед употреблением без стерилизации в автоклаве.
Допускается использовать сухой препарат промышленного производства - энтерококкагар.
2.4.15. Солевой агар с ТТХ
Сухой питательный агар по прописи на этикетке, хлорид натрия 65 г расплавляют при нагревании в 1000 мл дистиллированной воды. Осадок отфильтровывают, разливают мерно во флаконы, стерилизуют при (120 +/- 2) °C 20 мин. Перед употреблением в расплавленную основу из расчета на 100 мл добавляют: 1 г глюкозы, 2 мл дрожжевого экстракта или другого дрожжевого препарата, 1 мл водного 1% раствора ТТХ. Тщательно смешивают, разливают в чашки.
2.4.16. Желточно-солевой агар (ЖСА)
Сухой питательный агар по указанию на этикетке и 65 г хлорида натрия растворяют при нагревании в 1000 мл дистиллированной воды, разливают мерно в емкости, стерилизуют при (120 +/- 2) °C 20 мин. Перед употреблением в расплавленный и остуженный до 50 - 55 °C солевой агар прибавляют один стерильно приготовленный яичный желток, тщательно смешанный с 50 мл физиологического раствора с помощью стеклянных бус, перемешивают и разливают в чашки Петри тонким слоем по 12 - 15 мл.
Допускается использовать сухой препарат промышленного производства (стафилококкагар).
2.4.17. Среда Мюллера - Кауфмана
В 500 мл исследуемой воды вносят 25 мл 10%-ного пептона, 0,5 г желчных солей, 5 г кальция углекислого, 15 г натрия тиосульфата, 0,5 мл 0,1%-ного водного раствора бриллиантового зеленого, 10 мл раствора Люголя. Для приготовления раствора Люголя в 10 мл воды вносят 3 г йода кристаллического и 2,5 г калия йодистого.
2.4.18. Приготовление желчной соли по Олькеницкому
К 1000 мл желчи крупного рогатого скота прибавляют 40 г натрия гидрата окиси, гидролизуют в автоклаве при 120 °C 3 ч или 2 раза по 2 ч в посуде, исключая алюминиевую. После охлаждения в гидролизат прибавляют 100 мл 20%-ного водного раствора бария хлористого и прогревают в автоклаве при 100 °C 1 ч. Через 18 - 24 ч отстаивания сливают жидкость с осадка и фильтруют. К профильтрованному гидролизату прибавляют при постоянном помешивании 20%-ный раствор соляной кислоты до кислой реакции (рН 6,4 - 6,6) и оставляют на 18 - 24 ч. Надосадочную жидкость сливают, осадок промывают водой, прибавляют при нагревании 40%-ный раствор натрия гидрата окиси до слабощелочной реакции (рН 7,2 - 7,4) и выливают на противень для подсушивания в сушильном шкафу при 115 °C до порошкообразного состояния. Из 1000 мл желчи можно получить 36 г смеси желчных солей. Следует остерегаться перещелачивания при последней операции. Хранят соли в темной банке с притертой пробкой.
2.4.19. Селенитовая среда Лейфсона
Готовят из сухого препарата промышленного производства по указанию на этикетке.
Для приготовления селенитового бульона двойной концентрации увеличивают навеску сухого препарата в два раза на тот же объем дистиллированной воды.
2.4.20. Магниевая среда
Приготовление 100 мл среды обычной и двойной концентрации.
Готовят раздельно растворы А, Б, В по нижеследующей прописи:
---------T----------------------------T------------T-------------¬
¦Растворы¦ Ингредиенты ¦ Обычная ¦ Удвоенная ¦
¦ ¦ ¦концентрация¦концентрация ¦
+--------+----------------------------+------------+-------------+
¦ А ¦Пептон ферментативный ¦0,42 г ¦0,84 г ¦
+--------+----------------------------+------------+-------------+
¦ ¦Натрий хлористый ¦0,7 г ¦1,4 г ¦
+--------+----------------------------+------------+-------------+
¦ ¦Калий фосфорно-кислый ¦0,15 г ¦0,3 г ¦
¦ ¦однозамещенный ¦ ¦ ¦
+--------+----------------------------+------------+-------------+
¦ ¦Дрожжевой экстракт ¦2,0 мл ¦4,0 мл ¦
+--------+----------------------------+------------+-------------+
¦ ¦Вода дистиллированная ¦89,0 мл ¦89,0 мл ¦
+--------+----------------------------+------------+-------------+
¦ Б ¦Магний хлористый ¦3,6 г ¦7,2 г ¦
¦ ¦кристаллический ¦ ¦ ¦
+--------+----------------------------+------------+-------------+
¦ ¦Вода дистиллированная ¦9,0 мл ¦9,0 мл ¦
+--------+----------------------------+------------+-------------+
¦ В ¦Бриллиантовый зеленый ¦0,5 мл ¦1,0 мл ¦
¦ ¦0,1%-ный водный раствор ¦ ¦ ¦
L--------+----------------------------+------------+--------------
Ингредиенты растворяют, кипятят в течение 10 мин., затем растворы А, Б и В сливают в одну колбу.
Для посева больших объемов воды можно предварительно готовить навески и растворы ингредиентов среды в расфасованном виде, которые затем вносят в исследуемую воду в соответствии с нижеследующей прописью:
------------------------------------------------T----------------¬
¦ Ингредиенты ¦Объем пробы воды¦
¦ +--------T-------+
¦ ¦ 500 мл ¦100 мл ¦
+-----------------------------------------------+--------+-------+
¦Магний хлористый кристаллический ¦19,5 г ¦3,9 г ¦
+-----------------------------------------------+--------+-------+
¦Натрий хлористый ¦4,0 г ¦0,8 г ¦
+-----------------------------------------------+--------+-------+
¦Калий фосфорно-кислый однозамещенный безводный ¦0,8 г ¦0,16 г ¦
+-----------------------------------------------+--------+-------+
¦10%-ный раствор пептона ¦25,0 мл ¦5,0 мл ¦
+-----------------------------------------------+--------+-------+
¦Дрожжевой экстракт ¦11,0 мл ¦2,5 мл ¦
+-----------------------------------------------+--------+-------+
¦Бриллиантовый зеленый 0,1%-ный водный раствор ¦2,5 мл ¦0,5 мл ¦
L-----------------------------------------------+--------+--------
Все навески можно соединить в одной емкости в виде жидкой кашицы. Уже через 24 ч хранения при комнатной температуре происходит стерилизация концентрата. Дополнительная стерилизация не требуется.
2.4.21. Тетратианатная среда накопления по Preuss
К 1000 мл мясопептонного бульона добавляют 5 мл 0,1%-ного водного раствора кристаллического фиолетового, стерилизуют при (112 +/- 2) °C 12 мин. После охлаждения добавляют 20 г тетратианата калия, устанавливают рН 6,5. Среду разливают в стерильные емкости необходимого для последующего посева размера. Срок хранения - до одной недели при температуре 4 °C.
2.4.22. Висмут-сульфитный агар
Готовят из сухого препарата промышленного производства по указанию на этикетке.
2.4.23. Приготовление SS-агара
Готовят из сухого препарата промышленного производства по указанию на этикетке.
2.4.24. Приготовление индикаторных бумажек для определения
продукции индола
4 г парадиметиламинобензальдегида растворяют в 50 мл этилового спирта 96°, добавляют 10 мл ортофосфорной кислоты (очищенной, концентрированной). Реактивом смачивают полоски из фильтровальной бумаги на 1/3 их длины. Смоченный конец - лимонно-желтый. Высушенные индикаторные бумажки можно сохранять в темноте длительное время. Чувствительность бумажек возрастает при замене этилового спирта на амиловый или изоамиловый.
2.4.25. Среда с триптофаном
10 г ферментативного пептона, 5 г натрия хлористого, 1 г триптофана растворяют 1000 мл дистиллированной воды, устанавливают рН - 7,2, разливают в стерильные пробирки по 5 - 6 мл и автоклавируют при (120 +/- 2) °C 20 мин.
2.4.26. Реактив Ковача
5 г парадиметиламинобензальдегида растворяют в 75 мл амилового спирта на водяной бане при 60 °C. Затем медленно добавляют 25 мл концентрированной соляной кислоты. Приблизительно через 6 ч, после изменения цвета, реактив готов для употребления. Цвет готового реактива должен быть от светло-желтого до светло-коричневого. При использовании некачественного амилового спирта реактив может приобрести темный цвет. Реактив следует хранить при температуре 4 °C в темном месте во флаконе из коричневого стекла. Срок хранения - две недели.
2.5. Подготовка к анализу
2.5.1. Подготовка проб воды
Перед посевом пробу тщательно перемешивают и фламбируют горящим тампоном край емкости. Используемые пробирки и чашки маркируют.
Перед каждым отбором новой порции воды для анализа пробу перемешивают продуванием воздуха стерильной пипеткой.
2.5.2. Приготовление разбавлений
Для посева объемов воды меньших, чем 1 мл, используют разбавления анализируемой воды. Перед посевом растворы для разбавления (п. 2.4.2) разливают по 9 мл в пробирки с соблюдением правил стерильности. Затем в первую пробирку с 9 мл раствора вносят 1 мл анализируемой воды. При этом пипетка не должна быть опущена ниже поверхности воды, чтобы избежать смывания бактерий с наружной стороны. Другой стерильной пипеткой продуванием воздуха тщательно перемешивают содержимое пробирки, отбирают из нее 1 мл и переносят в чашку Петри, что будет соответствовать посеву 0,1 мл анализируемой воды. При необходимости посева меньших объемов этой же пипеткой переносят 1 мл содержимого первой пробирки в следующую пробирку с 9 мл раствора для разбавления. Другой стерильной пипеткой делают посев 1 мл из второй пробирки, что будет соответствовать посеву 0,01 мл анализируемой воды. В случаях высокого уровня загрязнения воды разбавление продолжают аналогично, каждый раз меняя пипетку.
Время от момента приготовления разбавлений и заливки питательным агаром не должно превышать 30 мин.
2.6. Методика работы при использовании мембранных фильтров
Подготовка мембранных фильтров, фильтровального аппарата, выполнение фильтрования воды - в соответствии с МУК 4.2.1018-01 "Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды".
2.7. Определение общих и термотолерантных колиформных
бактерий методом мембранной фильтрации
2.7.1. Определение понятия показателей
Общие колиформные бактерии (ОКБ) - грамотрицательные, оксидазоотрицательные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты и газа при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 - 48 ч.
Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) входят в число общих колиформных бактерий, обладают всеми их признаками и, кроме того, способны ферментировать лактозу до кислоты и газа при температуре (44 +/- 0,5) °C в течение 24 ч.
2.7.2. Значение показателей и область применения
ОКБ - основной нормируемый показатель при оценке качества воды водоемов в местах водозаборов для централизованного водоснабжения, рекреации, в черте населенных пунктов. ОКБ - интегральный показатель степени фекального загрязнения, который включает ТКБ, Е.coli и поэтому обладает индикаторной надежностью в отношении возбудителей бактериальных кишечных инфекций. ОКБ - наиболее чувствительный показатель при выявлении источников фекального загрязнения, в том числе небольших.
ТКБ рекомендуется определять одновременно в одном и том же посеве с ОКБ для подтверждения фекального происхождения загрязнения. Уровни ОКБ и ТКБ в воде водоемов, загрязняемых сточными водами, близки, различия находятся в пределах ошибки метода. По мере удаления от источника загрязнения и воздействия факторов самоочищения различия в численности этих групп индикаторов возрастают.
При высоком антропогенном, в частности, химическом загрязнении водоемов, сбросах недостаточно обеззараженных сточных вод, нарушении естественного статуса водоема (зарегулированные водоемы, каналы и т.п.) возможно снижение индикаторного значения лактозоположительных ОКБ и ТКБ в результате их более интенсивного отмирания, чем патогенные (сальмонеллы) и условно-патогенные бактерии семейства Еnterobacteriaceae. Если при этом центром госсанэпиднадзора установлено несоответствие данных анализа по ОКБ и ТКБ (менее 1000 и 100 КОЕ соответственно) и при неблагоприятной санитарно-гигиенический обстановке (нарушение режима в зонах санитарной охраны водопроводов, сброс сточных вод, урбанизации территорий водосбросов и т.п.), следует обратить внимание на рост лактозоотрицательных колоний, определить их принадлежность к бактериям семейства Еnterobacteriaceae (по отрицательному оксидазному тесту и ферментации глюкозы до кислоты и газа) и включить их в число ОКБ при выдаче результата.
2.7.3. Выполнение анализа
2.7.3.1. Определение общих колиформных бактерий.
Объем воды для посева выбирают в зависимости от степени ее предполагаемого загрязнения с таким расчетом, чтобы не менее чем на 2 фильтрах выросли изолированные колонии. При этом можно ориентироваться на результаты предыдущих исследований и на рекомендации Приложения 9.
При исследовании воды неизвестной степени бактериального загрязнения следует засевать не менее 4 десятикратных ее объемов.
Отмеренный объем воды фильтруют через мембранные фильтры с соблюдением требований, изложенных в п. 2.6.
Фильтр переносят не переворачивая на среду Эндо, приготовленную по п. 2.4.5, и добиваются полного прилегания его к среде без пузырьков воздуха. Чашки с посевами помещают в термостат дном вверх и инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 18 - 24 ч.
Для учета выбирают фильтры, на которых выросли изолированные типичные для лактозоположительных бактерий колонии: темно-красные, красные, с металлическим блеском и без него, слизистые с темно-малиновым центром с отпечатком на обратной стороне фильтра. Для повышения точности анализа учет ведут не менее чем на двух фильтрах с числом типичных для колиформных бактерий колоний не менее 10 и не более 30 для фильтров с диаметром диска 35 мм и не менее 15 и не более 50 для фильтров с диаметром диска 47 мм. Допустимо вести учет по 1 фильтру или на фильтрах с более густым ростом, но с обязательной оговоркой в приложении к протоколу анализа.
Выполняют оксидазный тест одним из методов.
1. Мембранный фильтр с выросшими на нем колониями переносят на кружок фильтровальной бумаги несколько большего диаметра, чем фильтр, обильно смоченный реактивом для определения оксидазной активности (п. 2.4.9, вар. 1 или 2), или на диск СИБ-оксидаза, смоченный дистиллированной водой. При появлении первых признаков положительной реакции, но не более чем через 5 мин., мембранный фильтр переносят обратно на среду Эндо. После четкого проявления реакции определяют результат. При появлении фиолетово-коричневого или синего окрашивания колоний (в зависимости от примененного реактива) оксидазный тест считают положительным.
2. Полоску фильтровальной бумаги помещают в чистую чашку Петри и смачивают 2 - 3 каплями реактива для оксидазного теста. Бумажные системы промышленного производства смачивают дистиллированной водой. Подсчитывают типичные колонии каждого типа и по 3 - 4 изолированные колонии из них платиновой петлей или стеклянной палочкой (металлическая петля из нихрома дает ложноположительную реакцию при работе с реактивом тетраметил-п-фенилендиамином) наносят штрихом на подготовленную фильтровальную бумагу. Реакция считается положительной, если в течение 1 мин. появляется сине-фиолетовое окрашивание штриха. При отрицательной реакции цвет в месте нанесения культуры не меняется.
Примечание. Методом 2 следует проводить определение оксидазной активности при росте на фильтрах изолированных колоний или при получении чистых культур после рассева на среде Эндо, поскольку при наложении или соприкосновении колоний колиформных бактерий с оксидазоположительными колониями посторонних бактерий можно получить ложноположительную реакцию и неоправданно отбросить из учета колонии бактерий, являющихся индикаторами фекального загрязнения.
Метод 2 дает ошибку определения при нерепрезентативной выборке колоний для исследования в отличие от метода 1, с помощью которого выявляется оксидазная активность одновременно всех выросших колоний.
Все оксидазоположительные колонии из учета исключают. Среди колоний, не изменивших первоначального цвета (оксидазоотрицательных), подсчитывают число типичных лактозоположительных колоний (с отпечатками на обратной стороне фильтра до выполнения оксидазного теста).
При лабораторно-производственном контроле за эксплуатируемыми объектами анализ может быть завершен подсчетом таких колоний, которые отнесены к ОКБ по двум признакам: отрицательному оксидазному тесту и ферментации лактозы на лактозной среде Эндо до кислоты.
Дальнейшее подтверждение ОКБ по способности образовывать газ на лактозных средах проводят в следующих случаях:
- при отсутствии достаточно четкой дифференциации лактозоположительных колоний;
- при росте мелкоточечных или мелких плоских колоний, не характерных для колиформных бактерий;
- при небольшом опыте работы выполняющего анализ.
В этих случаях по 2 - 3 колонии каждого подсчитанного типа оксидазоотрицательных колоний сразу же после постановки оксидазного теста пересевают в одну из подтверждающих сред с лактозой (п. 2.4.7).
Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 48 ч. Первичный учет на подтверждающих полужидких средах и СИБ возможен через 4 - 6 ч. При обнаружении кислоты и газа дают положительный ответ. При отсутствии кислоты и газа или при наличии только кислоты пробирки с посевами оставляют для следующего просмотра через 24 ч, а при отрицательном результате для окончательного учета через 48 ч.
2.7.3.2. Определение термотолерантных колиформных бактерий.
После постановки оксидазного теста с тех же фильтров с изолированными колониями, которые были выбраны для учета ОКБ, выполняют посев типичных оксидазоотрицательных колоний на одну из подтверждающих сред с лактозой (п. 2.4.7). При числе колоний менее 15 они исследуются все, а более 15 - подсчитывают колонии разных типов и исследуют по 4 - 5 колоний каждого из них. Среда перед посевом должна быть прогрета до температуры 44 °C. Посевы сразу же переносят в термостат и инкубируют при температуре (44 +/- 0,5) °C в течение (24 +/- 1) ч. При использовании полужидких сред и СИБ первичный учет можно проводить через 4 - 6 ч. При обнаружении кислоты и газа дают положительный ответ. При иных реакциях посевы оставляют в термостате для окончательного учета через 24 ч.
2.7.4. Учет результатов
Типичные колонии учитывают как ОКБ при отрицательном оксидазном тесте и образовании кислоты на лактозной среде Эндо. Среди этих колоний учитывают как ТКБ при подтверждении ферментации лактозы с образованием кислоты и газа при температуре 44 °C.
Если при выборочной проверке колоний одного типа получены неодинаковые результаты, то вычисляют числа ОКБ, ТКБ среди этого типа по формуле:
a x c
X = -----,
b
где:
X - число подтвержденных бактерий одного типа;
a - общее число колоний этого типа;
b - число проверенных из них;
c - число колоний с положительным результатом.
Подсчитывают число подтвержденных колоний ОКБ, ТКБ каждой группы отдельно. Подсчет ведут только на тех фильтрах, где количество изолированных колоний колиформных бактерий не более 30 - 50. Результат подсчета на каждом фильтре суммируют и по формуле определяют число КОЕ в 100 мл.
a x 100
X = -------,
V
где:
X - число КОЕ ОКБ или ТКБ в 100 мл;
a - число подтвержденных колоний в сумме;
V - объем воды, профильтрованный через фильтры, на которых велся учет.
Окончательный результат в протоколе анализа выдают: число КОЕ ОКБ в 100 мл, из них число КОЕ ТКБ в 100 мл.
В случаях сплошного роста на всех фильтрах и невозможности учета результатов анализа в протоколе отмечают "зарост фильтров" и анализ повторяют.
При отсутствии на фильтрах колоний колиформных бактерий число КОЕ будет меньше той величины, которая была бы определена в случае обнаружения в анализируемом объеме одной клетки ОКБ, ТКБ. При повторном анализе объем исследуемой воды увеличивают. В чистых водоемах фильтруют 100 мл.
2.8. Определение общих и термотолерантных колиформных
бактерий титрационным методом
2.8.1. Определение понятия показателя и его значение
по п. п. 2.7.1 и 2.7.2
2.8.2. Область применения
Титрационный метод может быть использован:
- при отсутствии материалов и оборудования, необходимых для выполнения анализа методом мембранной фильтрации;
- при анализе воды с большим содержанием взвешенных веществ;
- в случае преобладания в воде посторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированных колоний общих колиформных бактерий.
2.8.3. Выполнение анализа
Объем воды для посева выбирают с таким расчетом, чтобы в минимальных объемах или в наибольшем разбавлении получить один или несколько отрицательных результатов. При этом следует ориентироваться на результаты предыдущих исследований воды в этом же месте водоема и на рекомендации Приложения 10, а также таблиц расчета НВЧ (Приложение 8).
Выбирают схему посева в 2 или 3 параллельных рядах, учитывая при этом, что чем больше повторностей, тем выше точность получаемых результатов.
Каждый объем воды или ее разбавления засевают в лактозопептонную среду, приготовленную в соответствии с п. 2.4.6. Посев 10 мл анализируемой воды вносят в пробирки с 1 мл концентрированной лактозопептонной среды. 1 мл пробы воды и 1 мл из разбавлений вносят в пробирки с 10 мл среды нормальной концентрации.
Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 ч.
Полное отсутствие изменения среды позволяет дать отрицательный ответ.
Из посевов в среду накопления, где отмечено помутнение, образование кислоты и газа или только помутнение, производят высев петлей на сектора среды Эндо с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии. Посевы на среде Эндо инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 16 - 18 ч.
2.8.3.1. Определение общих колиформных бактерий.
При наличии в среде накопления помутнения и газообразования, а при высеве на подтверждающую среду типичных для лактозоположительных колоний (темно-красных с металлическим блеском или без него) выполняют оксидазный тест в соответствии с п. 2.7.3.1 методом 2 или путем нанесения капель реактива на часть сектора. При обнаружении оксидазоотрицательных колоний дают положительный ответ на наличие ОКБ в данном объеме пробы.
Наличие ОКБ требуется подтвердить:
- если в среде накопления имеет место сомнительная реакция (небольшое газообразование или только помутнение);
- если на среде Эндо выросли колонии с недостаточно четкими дифференциальными признаками лактозоположительных колиформных бактерий.
В этих случаях:
- проверяют наличие отпечатка на среде Эндо после снятия петлей подозрительных колоний;
- подтверждают способность к газообразованию при посеве изолированных 1 - 2 колоний каждого типа с каждого сектора на среду с лактозой в соответствии с п. 2.4.7 с последующей инкубацией посевов при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 ч.
При отсутствии изолированных колоний проводят рассев на среду Эндо общепринятыми бактериологическими методами.
Отрицательный ответ дают, если:
- в среде накопления нет признаков роста;
- на секторах среды Эндо нет роста;
- на секторах среды Эндо выросли не характерные для колиформных бактерий колонии (прозрачные, с неровными краями, расплывчатые, а также розовые без отпечатков на среде и т.п.);
- все колонии оказались оксидазоположительные;
- в подтверждающем тесте на среде с углеводом не отмечено газообразования.
2.8.3.2. Определение термотолерантных колиформных бактерий.
Для определения ТКБ работают с секторами среды Эндо, где выросли типичные лактозоположительные колонии, а в среде накопления обнаружено газообразование. Делают посев 2 - 3 изолированных колоний каждого типа с каждого сектора в пробирки с любой из лактозных сред, приготовленных в соответствии с п. 2.4.7.
Среду перед посевом нагревают на водяной бане или в термостате до 44 °C. Немедленно после посева пробирки помещают в термостат и инкубируют при температуре (44 +/- 0,5) °C в течение 24 ч. Допускается просмотр посевов через 4 - 6 ч.
При образовании газа в среде накопления, росте на среде Эндо лактозоположительных бактерий и выявлении способности этих бактерий ферментировать лактозу до кислоты и газа в течение 24 ч при температуре 44 °C дают положительный ответ на наличие в этом объеме пробы воды ТКБ. Во всех остальных случаях дают отрицательный ответ.
Для ускорения выдачи ответа на присутствие ТКБ производят высев 1 мл из объемов среды накопления, где отмечено помутнение и газообразование, в пробирки с лактозопептонной средой и поплавком или ваткой по п. 2.4.7.2 и прогретой предварительно до температуры 44 °C. Посевы выдерживают в термостате при температуре (44 +/- 0,5) °C в течение 24 ч. При обнаружении кислоты и газа дают положительный ответ.
2.8.4. Учет результатов
После определения положительных и отрицательных результатов на наличие ОКБ, ТКБ в объемах воды, засеянной в среду накопления, вычисляют наиболее вероятное число (НВЧ) КОЕ в 100 мл по одной из таблиц Приложения 8, соответствующей схеме посева и полученным результатам.
Для расчета выбирают 3 таких последовательных десятикратных разбавления или объема воды, засеянной в среду накопления, в которых получены как положительные, так и отрицательные результаты. Если имеют место сочетания положительных и отрицательных результатов, отсутствующие в таблицах, то при повторении таких сочетаний более чем в 1% случаев следует искать причины в неправильной технике выполнения анализа.
В протоколе анализа указывают: НВЧ КОЕ ОКБ в 100 мл, НВЧ КОЕ ТКБ в 100 мл. Доверительный интервал не указывают.
2.9. Определение колифагов прямым методом
2.9.1. Определение понятия показателя
Колифаги - бактериальные вирусы, способные лизировать кишечную палочку и формировать зоны лизиса (бляшки) через (18 +/- 2) ч при температуре (37 +/- 1) °C на ее газоне на питательном агаре.
2.9.2. Значение показателя и область применения
Колифаги являются нормируемым показателем и предназначены для проведения текущего контроля качества воды поверхностных водоемов, служащих источником для питьевого и хозяйственно-бытового водоснабжения, водоснабжения пищевых предприятий, для рекреационного водопользования, а также в черте населенных мест в отношении возможного вирусного загрязнения.
+
2.9.3. Подготовка тест-культуры E.coli K F Str-r
12
На всех этапах исследования используют бактериальную взвесь,
+
приготовленную следующим образом: культуру E.coli K F Str-r
12
(п. 2.2.6) засевают в пробирку со скошенным питательным агаром
со стрептомицином (п. 2.4.4). Через (18 +/- 2) ч инкубации при
температуре (37 +/- 1) °C производят смыв бактерий с косяка
5 мл стерильного солевого раствора (п. 2.4.2.1) и по стандарту
9
мутности готовят взвесь E.coli в концентрации 10 бактериальных
клеток в 1 мл.
+
Допускается в день анализа внести культуру E.coli K F Str-r
12
в питательный бульон, при 37 °C инкубировать в течение 4 ч и
использовать при внесении в питательный агар, расплавленный и
остуженный до (44 +/- 1) °C.
2.9.4. Выполнение анализа
Объем воды для посева выбирают в зависимости от степени ее
загрязнения с таким расчетом, чтобы на чашках выросло до 300 БОЕ,
без образования сливных зон. При посеве на чашку Петри 1 мл или
соответствующих десятикратных разбавлений используют питательный
агар в обычной прописи (п. 2.4.4), при посеве 100 мл исследуемой
воды - питательный агар двойной концентрации (п. 2.4.4). В
зависимости от плотности используемого агара проводят посевы воды
по 10 мл на 10 чашек или по 20 мл на 5 чашек. Для освобождения
исследуемой воды от сопутствующей бактериальной флоры ее
обрабатывают хлороформом из расчета 1 мл хлороформа на 10 мл воды.
Пробу тщательно встряхивают и отстаивают в течение 15 мин. при
комнатной температуре для осаждения хлороформа. На исследование
берут воду над хлороформом. В питательный агар (п. 2.4.4),
расплавленный и остуженный до (44 +/- 1) °C, добавить смыв
+
E.coli K F Str-r (п. 2.9.3) из расчета 1,0 мл смыва на каждые
12
100 мл агара, перемешать. Для контроля культуры Е.coli на
возможную контаминацию ее посторонними колифагами в одну чашку
Петри вносят 10 мл стерильной водопроводной воды, прогретой до
20 - 25 °C, заливают 25 мл приготовленного агара с
+
E.coli K F Str-r и осторожно перемешивают.
12
Исследуемые объемы воды вносят в стерильные чашки Петри и заливают, слегка приоткрывая крышки, 25 мл смеси агара с кишечной палочкой. При посеве 100 мл воды температуру пробы предварительно доводят до 20 - 25 °C.
Содержимое чашек осторожно перемешать и оставить при комнатной температуре до застывания. Чашки с застывшим агаром поместить дном вверх в термостат и инкубировать при температуре (37 +/- 1) °C в течение (18 +/- 2) ч.
2.9.5. Учет результатов
Просмотр посевов осуществляется в проходящем свете.
При исследовании 100 мл воды (5 чашек по 20 мл) подсчитывают и суммируют все бляшки, выросшие на чашках Петри.
Если посевная доза была меньше 100 мл, то число колифагов вычисляют по формуле:
a x 100
X = -------,
V
где:

РАСПОРЯЖЕНИЕ МПР РФ от 03.03.2004 n 119-р О СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ УЧЕТА ИСТОЧНИКОВ НЕГАТИВНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ОКРУЖАЮЩУЮ СРЕДУ  »
Постановления и Указы »
Читайте также