МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ, ПОЛУЧЕННОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУ 2.3.2.1830-04 (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 09.01.2004)


Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
9 января 2004 года
Дата введения -
1 февраля 2004 года
2.3.2. ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ
ОЦЕНКА ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ, ПОЛУЧЕННОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУ 2.3.2.1830-04
1. Разработаны ГУ Научно-исследовательским институтом эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН: А.Л. Гинцбург - руководитель, Н.А. Зигангирова, Б.С. Народицкий, Л.Н. Нестеренко, И.А. Шагинян, М.Ю. Чернуха, Ю.В. Ананьина; Министерством здравоохранения РФ, Департаментом Госсанэпиднадзора МЗ РФ: Г.Г. Онищенко, А.И. Петухов; Институтом питания РАМН: В.А. Тутельян, С.А. Шевелева; Институтом вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН: Б.Ф. Семенов; Московским государственным университетом прикладной биотехнологии Министерства общего и профессионального образования Российской Федерации: И.А. Рогов, А.Ф. Валихов, В.И. Ганина.
2. Утверждены 9 января 2004 г., введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации с 1 февраля 2004 г.
3. Введены впервые.
1. Общие положения и область применения
1.1. Методические указания устанавливают требования к проведению микробиологической и молекулярно-генетической оценки пищевой продукции, полученной с использованием генетически модифицированных микроорганизмов (далее - ГММ).
1.2. Методические указания предназначены для учреждений санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, а также для других учреждений, аккредитованных на проведение работ в этой области в установленном порядке.
1.3. Требования, изложенные в настоящих Методических указаниях в отношении пищевой продукции, полученной с использованием ГММ, применяются на этапах постановки на производство, санитарно-эпидемиологической экспертизы, выдачи заключения по санитарно-эпидемиологической экспертизе, закупки, ввоза в страну и реализации.
1.4. Методические указания разработаны с целью обеспечения единого, научно обоснованного подхода к оценке качества и безопасности пищевой продукции, полученной с использованием ГММ, на этапах разработки, экспертизы и выдачи санитарно-эпидемиологического заключения для этой продукции.
1.5. Производитель пищевой продукции, полученной с использованием ГММ, предназначенной для реализации на территории Российской Федерации, при маркировке должен вносить информацию на этикетку об использовании ГММ в соответствии с установленным порядком.
2. Нормативные ссылки
2.1. Федеральный закон "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" N 52-ФЗ от 30.03.99.
2.2. Федеральный закон "О внесении изменений и дополнений в Закон Российской Федерации "О защите прав потребителей" N 2-ФЗ и Кодекс РСФСР об административных правонарушениях" от 9 января 1996 г. (ред. от 30.12.01).
2.3. Федеральный закон "О качестве и безопасности пищевых продуктов" N 29-ФЗ от 02.01.00.
2.4. Федеральный закон "О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности" N 86-ФЗ от 05.06.96 (ред. от 12.07.00).
2.5. Федеральный закон "О внесении изменений и дополнений в Федеральный закон о государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности" N 96-ФЗ от 21.06.00.
2.6. "Основы законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан" от 22 июля 1993 г. N 5487-1 (ред. от 30.06.03).
2.7. Положение о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании, утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации N 554 от 24.07.00.
2.8. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации "О порядке гигиенической оценки и регистрации пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников" N 7 от 06.04.99.
2.9. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации "О проведении микробиологической и молекулярно-генетической экспертизы генетически модифицированных микроорганизмов, используемых в производстве пищевых продуктов" N 149 от 16.09.03.
2.10. Гигиенические требования к безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. СанПиН 2.3.2.1078-01.
2.11. Приказ Минздрава РФ "О санитарно-эпидемиологической экспертизе продукции" N 325 от 15.08.01 (ред. от 18.03.02) (зарегистрированный в МЮ РФ 19.10.01, N 2978).
3. Порядок санитарно-эпидемиологической экспертизы
и выдачи санитарно-эпидемиологического заключения пищевой
продукции, полученной с использованием ГММ
3.1. Вся пищевая продукция, полученная с использованием жизнеспособных микроорганизмов, проходит санитарно-эпидемиологическую экспертизу в установленном порядке. Заявитель должен декларировать наличие генных модификаций у штаммов, используемых для производства продуктов питания.
3.2. Проведение санитарно-эпидемиологической экспертизы и выдачи заключения по санитарно-эпидемиологической экспертизе пищевой продукции, полученной с использованием ГММ, осуществляется в соответствии с порядком, установленным:
- Постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации "О порядке гигиенической оценки и регистрации пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников" N 7 от 06.04.99;
- Постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации "О проведении микробиологической и молекулярно-генетической экспертизы генетически модифицированных микроорганизмов, используемых в производстве пищевых продуктов" N 149 от 16.09.03;
- Приказом Минздрава РФ "О санитарно-эпидемиологической экспертизе продукции" N 325 от 15.08.01 (ред. от 18.03.02) (зарегистрированным в МЮ РФ 19.10.01, N 2978).
3.3. Юридические лица и индивидуальные предприниматели представляют в центр санитарно-эпидемиологического нормирования, гигиенической сертификации и экспертизы Министерства здравоохранения Российской Федерации комплект документов и материалов, включающий:
- заявку (письмо) на проведение гигиенической оценки и санитарно-эпидемиологической экспертизы пищевой продукции, полученной с использованием ГММ;
- материалы, отражающие медико-генетическую оценку пищевой продукции, полученной с использованием ГММ;
- материалы, отражающие технологические свойства пищевой продукции, полученной с использованием ГММ;
- материалы, отражающие медико-биологическую оценку пищевой продукции, полученной с использованием ГММ;
- материалы, отражающие молекулярно-биологические и микробиологические характеристики ГММ:
1) документацию, подтверждающую таксономическую принадлежность штамма, установленную по фенотипическим и генотипическим свойствам (паспорт штамма);
2) название штамма, соответствующее кодам Международной номенклатуры;
3) свидетельство о депонировании штамма;
4) документацию, содержащую сведения о фенотипических и генотипических характеристиках штамма, включая информацию о наличии плазмид;
5) документацию, подтверждающую происхождение и подлинность микроорганизма-реципиента, включая документацию о всех известных генетических модификациях его, индуцированных как генно-инженерными, так и традиционными методами;
6) источник и нуклеотидную последовательность целевого гена и его регуляторных элементов;
7) цель генной модификации;
8) происхождение и таксономическое положение штамма-донора, установленные методами молекулярной геносистематики;
9) характеристику средств доставки целевого гена в клетки реципиента (физическую карту вектора, наличие полилинкеров и селективных маркеров);
10) стабильность интеграции чужеродной ДНК в хромосому или плазмиду ГММ;
11) использование транспозонов при конструировании штаммов ГММ;
12) фенотипические, биологические, патогенные свойства ГММ, взаимодействие с резидентной флорой кишечника человека;
13) стабильность генотипических и фенотипических характеристик ГММ;
14) способность к передаче генетического материала от ГММ в резидентную флору кишечника человека и в клетки макроорганизма.
Кроме вышеперечисленного, заявитель должен предоставить сведения об официальном разрешении на применение в пищевой промышленности и/или в свободной продаже населению и о разрешении на экспорт из страны продукта с данным ГММ (оригиналы или заверенные копии документов установленного образца).
3.4. Объем и программа проведения работ по оценке качества и безопасности пищевой продукции, полученной с использованием ГММ, определяются экспертами ГУ НИИ питания РАМН и Центра по экспертизе ГУ НИИЭМ им. Гамалеи РАМН по результатам экспертизы представленных материалов, а также в зависимости от ее принадлежности к пищевым продуктам на основе:
- новых штаммов, не имеющих разрешения на применение в производстве пищевых продуктов;
- штаммов, проходивших ранее экспертизу в установленном порядке и допущенных в качестве заквасочных, стартовых, пробиотических, дрожжевых культур и штаммов - продуцентов пищевых веществ и пищевых добавок и используемых в пищевой промышленности.
Кроме того, при этом учитывается группа продукции по признаку наличия ГММ в жизнеспособном состоянии на момент потребления:
1) пищевые продукты, содержащие ГММ в живом состоянии, - кисломолочные, пробиотические продукты, напитки брожения и пиво непастеризованные, закваски и стартовые культуры, готовые мясные продукты, изготовленные с использованием стартовых культур;
2) пищевые продукты, изготовленные при помощи ГММ и в которых в процессе технологии они были инактивированы (напитки брожения и пиво пастеризованные, термизированные кисломолочные продукты и др.);
3) пищевые продукты, изготовленные при помощи ГММ и которые в дальнейшем освобождены от них в процессе производства (ферментные препараты, белки).
Для концентрации внимания экспертизы на продукции, представляющей наибольший риск, последняя группа подразделяется на "негативный" и "позитивный" листы, при этом в негативный лист включаются полученные при использовании ГММ продукты, не содержащие белка и ДНК (пищевые кислоты, витамины, жирные кислоты), и ферменты для спиртовой промышленности.
Работа по экспертизе продукции, включенной в негативный лист, должна предусматривать первоочередный анализ документальных материалов и в случае необходимости - анализ при помощи лабораторных методов.
3.5. Для проведения работ по оценке качества и безопасности пищевой продукции, полученной с использованием ГММ, фирма-изготовитель поставляет образцы продукции и используемые культуры штаммов ГММ в количестве, необходимом для проведения полного объема исследований.
3.6. На основании экспертизы представленных документов и материалов и результатов проведенных молекулярно-генетических, микробиологических и технологических исследований продукции центр санитарно-эпидемиологического нормирования, гигиенической сертификации и экспертизы Минздрава России оформляет бланк санитарно-эпидемиологического заключения (или мотивированное заключение об отказе) и передает его на подпись в Департамент Госсанэпиднадзора Минздрава России. Санитарно-эпидемиологическое заключение подписывается Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, а в его отсутствие - начальником Департамента Госсанэпиднадзора, заместителем Главного государственного санитарного врача Российской Федерации.
4. Микробиологическая оценка ГММ, используемых
для производства пищевой продукции
Необходимость проведения тех или иных исследований по данному разделу и для каждого конкретного вида пищевой продукции, полученной с использованием ГММ, определяется экспертом центра по экспертизе ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.
4.1. Сравнительный анализ фенотипических свойств
ГММ, штамма-реципиента или референтного штамма
4.1.1. Сущность метода
Сравнительный анализ фенотипических свойств основан на идентификации основных фенотипических свойств исследуемого ГММ, штамма-реципиента или референтного штамма того же вида для определения стабильности фенотипических признаков.
Оптимальными методами исследования фенотипических свойств являются методы идентификации микроорганизмов с помощью диагностических панелей, выпускаемых отечественными и зарубежными производителями и разрешенных к использованию в установленном порядке. Данные системы одноразового пользования предназначены для определения биохимической активности и последующей идентификации в течение 18 - 24 часов. Дополнительными методами исследования фенотипических свойств являются чувствительность к антибиотикам, к бактериофагам (для некоторых видов ГММ).
4.1.2. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды
4.1.2.1. Аппаратура и инструментарий
НД (ГОСТ, ТУ)
Анализатор потенциометрический, погрешность
измерений РН +/- 0,01 ГОСТ 19881-74
Шкаф сушильный стерилизационный ШСС-80П или
других марок, позволяющий поддерживать
температуру (160 +/- 5) °С ТУ 64-1-28-70-76
Термостат, позволяющий поддерживать
рабочую температуру 28 - 37 °С с отклонением
от заданной +/- 1 °С ТУ 64-1-1382-72
Баня водяная с подогревом ГОСТ 12026-76
Весы лабораторные общего назначения
2 и 4 класса точности, с наибольшим
пределом взвешивания 200 г ГОСТ 24104-88
Микроскоп биологический МБИ-2,
МБИ-3, МБР-3 ГОСТ 8284-78
Стерилизаторы паровые медицинские
или аналогичные ГОСТ 19569-89Е
Дистиллятор, обеспечивающий качество
дистиллированной воды ГОСТ 6709-72
Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150
или других видов ТУ 16-535-84
Холодильник бытовой электрический
Пинцет медицинский ГОСТ 21241-89
Ножницы медицинские ГОСТ 21239-89
Скальпель хирургический, 15 см ГОСТ 21240-89
Штативы для пробирок
Часы механические сигнальные ГОСТ 3145-84
Микроволновая печь
4.1.2.2. Лабораторная посуда и материалы
Бумага фильтровальная лабораторная ГОСТ 12026-76
Бутыли стеклянные для химических реактивов
Кастрюли эмалированные ГОСТ 24778-81
Марля медицинская ГОСТ 9412-77
Колбы плоскодонные конические или
круглые разной вместимости ГОСТ 1770-74
Воронки стеклянные ГОСТ 25336-82
Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 5556-81
Полистироловые планшеты U-образные
Пробирки типов П1, П2 ГОСТ 25336-82
Стекла предметные для микропрепаратов ГОСТ 6672-75
Ступка фарфоровая с пестиком ГОСТ 9147-80
Термометр ртутный с диапазоном измерения
от 0 до 100 °С (цена деления шкалы 1 °С) ГОСТ 13646-68
Чашки биологические (Петри) ГОСТ 23932-90
Книга-каталог кодов для идентификации
Бланки для регистрации результатов
Микробиологические петли
Фломастеры-маркеры
4.1.2.3. Реактивы и питательные среды
НД (ФС, ТУ)
Агар микробиологический ГОСТ 17206-84
Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72
D-глюкоза, ч ГОСТ 6038-79
D-лактоза, 1-водная ТУ 6-09-22-98-79
Натрий фосфорно-кислый однозамещенный, ч ГОСТ 4198-75
Натрий фосфорно-кислый двухзамещенный, хч ГОСТ 2493-75
Кислота соляная, хч ГОСТ 3118-77
Натрий хлористый, хч ГОСТ 4328-77
Масло иммерсионное для микроскопии ГОСТ 31739-78
Набор реактивов для окраски по Граму
Спирт этиловый ректификованный технический ГОСТ 18300-87
Спирт этиловый ректификованный ГОСТ 5962-67
Экстракт дрожжевой <*>
Триптон <*>
Антибиотики разных групп <*>
Диски с антибиотиками <*>
--------------------------------
<*> Реактивы производства разных фирм, прошедшие
государственную регистрацию и разрешенные для использования в
установленном порядке.
Питательные среды:
Для определения количества мезофильных
аэробных и факультативно-анаэробных
микроорганизмов ТУ 9229-083-00419785-97
Питательный бульон ТУ 10-02-02-789-176-94
Сухая питательная среда типа АГВ для
определения чувствительности к
антибиотикам ТУ 9229-083-00419785-97
Питательная среда Мюллер-Хинтона разных
фирм для определения чувствительности к
антибиотикам
Сухая питательная среда для определения
чувствительности к антибиотикам
диффузионным методом ГОСТ Р 51600-00
Питательные среды для определения ТУ 9229-072-00419785-97
энтеробактерий ГОСТ 29184-91
Среды для определения дрожжей и ТУ 9229-083-00419785-97
микроскопических грибов (агар Сабуро,
сывороточный и др.) ГОСТ 10444.12-88
Среды для определения S. aureus
(типа Байд-Паркера, солевой агар) ГОСТ 10444.1, п. 5.1,
п. 5.4
Среды для выращивания бифидобактерий,
молочнокислых и пропионово-кислых
бактерий (ГМС, М17, MRS) ТУ 10-02-02-789-192-95
Планшеты для идентификации культур,
выпускаемых отечественными и зарубежными
производителями и разрешенных к
использованию в установленном порядке
Реактивы для ряда тестов в зависимости
от идентифицируемого вида ГММ
Дезинфицирующий раствор
Микробиологические петли, скальпель
Стандарт мутности по McFarland
Допускается использование других коммерческих питательных сред и диагностических тест-систем аналогичного назначения для проведения исследований фенотипических свойств в соответствии с данным документом. При их применении необходимо руководствоваться рекомендациями изготовителя.
Питательные среды и биологические препараты импортного производства должны иметь сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000.
Питательные среды и препараты отечественного производства должны соответствовать нормативной документации, утвержденной в установленном порядке.
4.1.3. Методика проведения исследования
4.1.3.1. Выделение ГММ, штамма-реципиента или контрольного (референтного) штамма
Чистую культуру ГММ, штамма-реципиента или контрольного (референтного) штамма выделяют, пользуясь общепринятыми в микробиологии методами на рекомендованной для данного вида ГММ и штамма-реципиента питательной среде. Например, выделение чистой культуры ГММ вида термофильных стрептококков должно осуществляться со среды типа M17 по ГОСТ 51331-99, а лактобактерий - со среды MRS по ГОСТ 51339-99.
4.1.3.2. Постановка реакции биохимической идентификации ГММ, штамма-реципиента или контрольного (референтного) штамма
Из чистой 18 - 24-часовой культуры готовят суспензию в стерильной дистиллированной воде. Суспензию тщательно гомогенизируют. Суспензию доводят до определенной мутности по шкале McFarland в зависимости от исследуемого вида ГММ и штамма-реципиента. Неправильно приготовленная суспензия (слишком густая или очень жидкая) может привести к получению ложных результатов.
Параллельно суспензию ГММ, штамма-реципиента или контрольного штамма высевают на питательные среды для проверки чистоты культуры, ее ростовых свойств и/или постановки дополнительных тестов.
Планшет для идентификации извлекают из полиэтиленовой упаковки и на прилагаемом к планшету бланке регистрируют номер ГММ, штамма-реципиента и контрольного штамма.
Суспензию бактерий тщательно встряхивают и в каждую лунку инокулируют определенный объем суспензии (0,1 - 0,2 куб. см) в зависимости от фирмы-изготовителя и вида исследуемого ГММ и штамма-реципиента.
После инокуляции в ряд лунок может добавляться стерильное вазелиновое масло, полностью закрывающее внесенную суспензию клеток для создания анаэробных условий.
После инокуляции планшет накрывают крышкой и инкубируют 5 - 24 часа при оптимальной температуре для исследуемого вида ГММ (например, 25 - 28 °С - дрожжи, 42 °С - лактобациллы).
По окончании инкубации проверяют рост и чистоту культуры методом посевов на селективные жидкие или плотные питательные среды.
В некоторые лунки (например, ферментация индола) могут быть добавлены реактивы. Учет результатов на бета-галактозидазу проводят дважды: через 3 - 5 часов и через 18 - 24 часа. Результаты учитывают визуально с помощью таблицы "Интерпретация реакций" и заносят в бланки.
Идентификацию проводят с помощью таблиц и книг-каталогов кодов соответствующих фирм.
Стабильность фенотипических свойств ГММ и штамма-реципиента проверяют методом пассирования ГММ и штамма-реципиента на жидких и плотных питательных средах и дальнейшим через 3 - 5 пассажей трехкратным тестированием биохимических свойств ГММ и штамма-реципиента. Трехкратное совпадение всех исследованных биохимических реакций, выявленное при неоднократном пассировании культур (не менее 10 пассажей), будет свидетельствовать о стабильности фенотипических признаков ГММ и штамма-реципиента. Вариабельность результатов по 1 - 2 реакциям будет являться свидетельством необходимости постановки дополнительных тестов на стабильность фено- и генотипических признаков у ГММ и штамма-реципиента. Вариабельность результатов по большему числу реакций будет служить свидетельством нестабильности фенотипических признаков у ГММ.
4.1.3.3. Определение чувствительности к антимикробным препаратам ГММ, штамма-реципиента и контрольного штамма
Чувствительность к антимикробным препаратам может быть в ряде случаев хорошим маркером фенотипических свойств ГММ и штамма-реципиента. В определенных случаях, а именно тестирования пробиотиков, определение чувствительности к антимикробным препаратам является обязательным тестом в микробиологической и молекулярно-генетической оценке ГММ.
Основой для выбора антибактериальных препаратов, подлежащих включению в исследование, являются данные о природной устойчивости или чувствительности отдельных видов ГММ или их групп, о распространении среди них приобретенной резистентности, а также о клинической эффективности антибиотиков.
Современные стандартизованные методы оценки антибиотикорезистентности подразделяются на методы серийных разведений и диффузионные. В зависимости от вида ГММ и штамма-реципиента, предназначения ГММ тестирование будет выполняться как методом серийных разведений, так и диффузионным методом.
4.1.3.3.1. Подготовка к анализу
А. Метод серийных разведений
Постановка метода серийных разведений для оценки антибиотикорезистентности включает следующие этапы:
а) приготовление растворов антибиотиков;
б) приготовление питательных сред с растворами антибиотиков;
в) приготовление суспензии исследуемого ГММ, штамма-реципиента и контрольного штамма, стандартизация суспензии и инокуляция;
г) инкубация;
д) интерпретация результатов исследования.
Общими и очень важными этапами в методе серийных разведений являются: приготовление растворов антибиотиков, питательных сред, смешивание растворов антибиотиков и питательных сред.
4.1.3.3.2. Приготовление растворов антибиотиков
Используют основные растворы антибиотиков (пригодные для хранения) и рабочие, используемые "ex tempore" для приготовления питательных сред.
Основные растворы антибиотиков готовят в концентрации 1000 мкг/мл и выше. Навески антибиотиков для приготовления основных растворов готовят с учетом их активности. Расчет навески антибиотика для приготовления основного раствора проводят по формуле:
Вес (мг) =
Объем растворителя (мл) х Необходимая концентрация (мкг/мл)
= -----------------------------------------------------------.
Активность субстанции (содержание антибиотика в мкг/мл)
Из основных растворов готовят рабочие двукратные концентрации антибиотиков. Для приготовления рабочих растворов используется стерильная дистиллированная вода. Расчет навески антибиотика для приготовления основного раствора в случае, если активность антибиотика измеряется в ЕД, производится аналогично.
4.1.3.3.3. Приготовление сред, содержащих антибиотики для серийных разведений
Различают два основных варианта метода серийных разведений в бульоне: макрометод (в пробирках) и микрометод (в планшетах). Рабочие растворы антибиотиков для обоих методов готовят по одинаковой схеме. Отличием является то, что серийные разведения антибиотика делают не в дистиллированной воде, а в жидкой питательной среде. Жидкая питательная среда, прошедшая контроль качества, готовится в соответствии с инструкцией изготовителя.
При постановке методов серийных разведений проводят контроль роста культуры на среде без антибиотика, а качество среды и антибиотиков контролируют с использованием референтных штаммов данного вида. Контролируется также чистота суспензии ГММ, использованного для инокуляции, путем высева на неселективные среды.
4.1.3.3.4. Учет результатов
Учет результатов при постановке макро- и микрометодов проводят визуально по появлению видимой мутности или спектрофотометрически. За МПК принимают концентрацию, обеспечивающую полное подавление видимого роста.
Б. Дискодиффузионный метод
Постановка дискодиффузионного метода оценки антибиотикорезистентности включает следующие этапы:
- приготовление питательных сред;
- приготовление суспензии микроорганизма и инокуляция;
- наложение дисков;
- инкубация;
- учет результатов.
Для получения правильных результатов необходимо жестко соблюдать правила хранения и использования коммерческих дисков.
4.1.3.3.5. Приготовление питательных сред
Приготовление чашек Петри с плотной питательной средой связано с некоторыми особенностями. Плотную питательную среду готовят в соответствии с инструкцией изготовителя. Перед заполнением чашки Петри расплавленной питательной средой ее устанавливают на строго горизонтальную поверхность, выверенную по уровню. Толщина агарового слоя должна быть 4,0 мм, что достигается при внесении в чашку Петри диаметром 100 мм 25 - 30 мл агаровой среды. Соблюдение указанных требований связано с тем, что размер и форма зоны ингибиции роста зависят от глубины и равномерности агарового слоя.
После заполнения чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. Перед инокуляцией суспензии чашки с плотной питательной средой контролируют на отсутствие конденсата жидкости на внутренней поверхности крышек.
4.1.3.3.6. Приготовление суспензии и инокуляция
Для приготовления инокулята используют 18 - 20-часовую
агаровую или 5 - 6-часовую бульонную культуру исследуемого ГММ.
Суспензию доводят до мутности стандарта McFarland 0,5 (конечная
7
концентрация около 1 - 2 х 10 КОЕ/куб. см).
Приготовленный инокулят в количестве 1 - 2 мл вносят на поверхность чашки Петри, равномерно по поверхности агара распределяют покачиванием. Избыток суспензии удаляют пипеткой. Приоткрытые чашки подсушивают при комнатной температуре в течение 10 - 15 минут.
4.1.3.3.7. Наложение дисков
Через 15 - 20 минут после инокуляции на поверхность питательной среды вносят диски с антибиотиками. Диски наносят с помощью автоматического распределителя дисков или стерильным пинцетом. На одну чашку диаметром 100 мм следует помещать не более 6 дисков с расстоянием между краем чашки и диска, а также между дисками 15 - 20 мм. Диски должны равномерно контактировать с поверхностью агара, для чего их следует аккуратно прижать пинцетом.
4.1.3.3.8. Инкубация и учет результатов
Чашки после наложения дисков помещают в термостат и инкубируют, перевернув их вверх дном, 18 - 20 часов при оптимальной температуре для исследуемого ГММ.
После окончания инкубации проводят учет результатов, измеряя диаметр зоны задержки роста с точностью до 1 мм. Для этого пользуются штангенциркулем или кронциркулем, раздвигая их концы до видимой зоны задержки роста и затем измеряя зону задержки в мм с помощью линейки.
4.2. Определение патогенных свойств ГММ, штамма-реципиента
и референтного (контрольного) штамма
При выявлении четко выраженной гемолитической и адгезивной активности ГММ и штамма-реципиента обязательными тестами на патогенные свойства ГММ и штамма-реципиента является определение вирулентных свойств ГММ и штамма-реципиента с использованием тканевых культур (HeLa, Hep-2, CHO), определением LD50 на модели беспородных мышей, интраназальной легочной модели, инвазивных свойств на тканевых культурах и в кератоконъюнктивальном тесте по Sereny. В зависимости от принадлежности ГММ и штамма-реципиента к определенному виду микроорганизмов выбираются наиболее адекватные методы определения вирулентных и инвазивных свойств ГММ. Ниже приведены методы, которые могут быть использованы в микробиологической и молекулярно-генетической оценке ГММ при приведенных выше условиях.
4.2.1. Определение гемолитической активности ГММ и штамма-реципиента
Определенные виды микроорганизмов продуцируют гемолизины, считающиеся факторами патогенности у бактерий, в связи с чем продукция гемолизина во многих случаях является маркером вирулентности. Определение гемолитической активности проводится в 2 этапа. На 1-м этапе на 5%-ный кровяной агар высевают исследуемый ГММ и штамм-реципиент. При продукции гемолизина через 18 - 24 часа при культивировании чашек Петри при оптимальной температуре развития гемолиза исследуемым ГММ вокруг колоний образуется видимая зона гемолиза и тем большая, чем больше гемолизина продуцируют ГММ и штамм-реципиент. При выявлении продукции гемолизина ГММ и штаммом-реципиентом проводят 2-й этап исследования, определяя титр гемолитической активности супернатантов ГММ и штамма-реципиента.
4.2.2. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды, используемые для определения патогенных свойств ГММ, штамма-реципиента и контрольного штамма вида, к которому относится ГММ
4.2.2.1. Аппаратура и инструментарий
НД (ГОСТ, ТУ)
Анализатор потенциометрический,
погрешность измерений РН +/- 0,01 ГОСТ 19881-74
Шкаф сушильный стерилизационный
ШСС-80П или других марок, позволяющий
поддерживать температуру (160 +/- 5) °С ТУ 64-1-28-70-76
Термостат, позволяющий поддерживать
рабочую температуру 28 - 37 °С
с отклонением от заданной +/- 1 °С ТУ 64-1-1382-72
Баня водяная с подогревом ГОСТ 12026-76
Весы лабораторные общего назначения,
2 и 4 класса точности, с наибольшим
пределом взвешивания 200 г ГОСТ 24104-88
Стерилизаторы паровые медицинские
или аналогичные ГОСТ 19569-89Е
Дистиллятор, обеспечивающий качество
дистиллированной воды ГОСТ 6709-72
Холодильник бытовой электрический
Микроцентрифуга типа "Эппендорф"
Пинцет медицинский ГОСТ 21241-89
Ножницы медицинские ГОСТ 21239-89
Скальпель хирургический, 15 см ГОСТ 21240-89
Штативы для пробирок
4.2.2.2. Лабораторная посуда и материалы
Бумага фильтровальная лабораторная ГОСТ 12026-76
Бутыли стеклянные для химических реактивов
Марля медицинская ГОСТ 9412-77
Колбы плоскодонные конические или круглые
разной вместимости ГОСТ 1770-74
Воронки стеклянные ГОСТ 25336-82
Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 5556-81
Полистироловые планшеты U-образные
Пробирки типов П1, П2 ГОСТ 25336-82
Ступка фарфоровая с пестиком ГОСТ 9147-80
Чашки биологические (Петри) ГОСТ 23932-90
Микробиологические петли
Фломастеры-маркеры
4.2.2.3. Реактивы и питательные среды
НД (ФС, ТУ)
Агар микробиологический ГОСТ 17206-84
Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72
D-глюкоза, ч ГОСТ 6038-79
D-манноза, хч ТУ 6-09-22-98-79
Натрий фосфорно-кислый однозамещенный, ч ГОСТ 4198-75
Натрий фосфорно-кислый двухзамещенный, хч ГОСТ 2493-75
Кислота соляная, хч ГОСТ 3118-77
Натрий хлористый, хч ГОСТ 4328-77
Спирт этиловый ректификованный
технический ГОСТ 18300-87
Спирт этиловый ректификованный ГОСТ 5962-67
Экстракт дрожжевой
Триптон
Селективные питательные среды для
конкретного ГММ, штамма-реципиента
и контрольного штамма: мезофильных
аэробных и факультативно-анаэробных
микроорганизмов ТУ 9229-083-00419785-97
для определения энтеробактерий ТУ 9229-072-00419785-97
для определения дрожжей и микроскопических ТУ 9229-083-00419785-97
грибов (агар Сабуро, сывороточный и др.) ГОСТ 10444.12-88
для определения S. aureus
(типа Байд-Паркера, солевой агар) ГОСТ 10444.1, п. 5.1,
п. 5.4
для выращивания бифидобактерий,
молочнокислых и пропионово-кислых бактерий
(ГМС, M17, MRS) ТУ 10-02-02-789-192-95
Дезинфицирующий раствор
Микробиологические петли
стандарт мутности по McFarland
5% взвесь эритроцитов человека, барана,
кролика, морской свинки
Питательные среды и биологические препараты импортного производства должны иметь сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000.
Питательные среды и препараты отечественного производства должны соответствовать нормативной документации, утвержденной в установленном порядке.
4.2.2.4. Проведение анализа
Взвесь эритроцитов человека, барана или другого вида млекопитающего добавляют к охлажденной до 50 - 55 °С плотной питательной среде с таким расчетом, чтобы взвесь эритроцитов составляла в агаре 5%. Смесь аккуратно перемешивают и разливают в чашки Петри. После застывания агара и подсушивания чашек на поверхность 5%-ного кровяного агара высевают в разведениях культуру ГММ или штамма-реципиента для формирования отдельных колоний. После посева чашки инкубируют в зависимости от вида микроорганизма в течение 24 - 48 часов при оптимальной для него температуре развития. Затем чашки Петри вынимают из термостата и осуществляют учет результатов. При продукции ГММ и штаммом-реципиентом гемолизина вокруг колоний формируются зоны гемолиза и тем большие, чем больше гемолизина продуцируют ГММ и штамм-реципиент.
При выявлении феномена продукции гемолизина ГММ и штаммом-реципиентом с колонии петлей осуществляют взятие материала, который высевают в пробирку с 3 мл обогащенной жидкой питательной среды (например, содержащую триптон, дрожжевой экстракт, аминокислоты). Пробирки инкубируют в течение 24 - 48 часов при оптимальной для ГММ температуре, после чего выращенные бактериальные клетки центрифугируют в центрифуге при 6000 об./мин. в течение 15 минут. Супернатант аккуратно отбирают наконечником микропипетки и переносят в чистую пробирку. Затем готовят 1%-ную взвесь эритроцитов барана или человека и разливают в пробирки по 1 куб. см (макрометод) или в U-лунки планшет по 0,1 куб. см (микрометод). Добавляют равный объем супернатанта исследуемого ГММ и штамма-реципиента. Инкубируют в течение 1 часа при 35 - 37 °С и производят предварительный учет результатов. Окончательный учет результатов осуществляют через 18 - 24 часа инкубации смеси эритроцитов и супернатанта при температуре 18 - 20 °С.
При положительном результате наблюдается гемолиз эритроцитов, представляющий визуально окрашенный прозрачный бульон. Последняя пробирка или лунка, в которой наблюдается гемолиз, отражает титр (количество) гемолизина, продуцируемого ГММ или штаммом-реципиентом. При отрицательном результате на дне пробирки или лунки формируется "пуговка" эритроцитов без изменения цвета бульона. Контроли: отрицательный - вместо супернатанта добавляется равный объем стерильного бульона, в котором проводилось выращивание культур; положительный - штамм гемолизпродуцирующей кишечной палочки, выращиваемый в тех же условиях, что и ГММ и штамм-реципиент.
4.3. Определение адгезивности ГММ и штамма-реципиента
Для пробиотиков определение адгезивности ГММ и штамма-реципиента является обязательным методом в микробиологической и молекулярно-генетической оценке ГММ, используемых в производстве пищевых продуктов. Для остальных видов ГММ определение адгезивности осуществляется на основании предварительного анализа справочных и нормативных документов, поступающих на экспертизу вместе с ГММ и штаммами-реципиентами.
Адгезивные свойства ГММ могут быть исследованы на ряде биологических моделей (развивающиеся куриные эмбрионы, энтерально зараженные мыши-сосунки, перевязанная петля тонкого кишечника кроликов) и методом гемагглютинации эритроцитов человека или животных. Наиболее простым и универсальным методом определения адгезивных свойств бактерий является выявление способности микроорганизмов вызывать гемагглютинацию эритроцитов человека и животных. В связи с этим адгезивность ГММ и штамма-реципиента первоначально будет определяться методом гемагглютинации. При выявлении способности ГММ и штамма-реципиента агглютинировать эритроциты человека и животных далее, в зависимости от вида ГММ, будет использоваться одна из биологических моделей на животных.
4.3.1. Определение адгезивности ГММ, штамма-реципиента и референтного штамма в отсутствие D-маннозы
Адгезивные свойства ГММ, штамма-реципиента и контрольного штамма первоначально определяются методом гемагглютинации эритроцитов человека или животных (мыши, крысы, кролика, барана и др.) в отсутствие D-маннозы (маннозо-чувствительная адгезия). При этом метод может выполняться в макро- (пробирках) и микровариантах (планшетах).
Выполнение метода включает следующие этапы:
- приготовление взвеси эритроцитов;
- приготовление суспензии микроорганизма;
- внесение в пробирки или в лунки планшет взвеси эритроцитов;
- внесение в пробирки или в лунки планшет суспензии культуры ГММ;
- аккуратное перемешивание смеси эритроцитов и суспензии культур;
- инкубация в термостате при 37 °С в течение 1 часа;
- предварительный учет результатов;
- инкубация смеси эритроцитов и суспензии микроорганизма при комнатной температуре в течение 18 часов;
- окончательный учет результатов.
Постановка реакции гемагглютинации с эритроцитами человека или животных включает следующие этапы.
Приготовление взвеси эритроцитов. Из тщательно отмытых эритроцитов готовят 1%-ную взвесь в стерильном физиологическом растворе. С этой целью к 1 куб. см эритроцитов, помещенных в 200 куб. см колбу, добавляют 99 куб. см стерильного физиологического раствора. Взвесь аккуратно перемешивают до образования однородной суспензии.
Приготовление суспензии ГММ. ГММ, выращенный на плотной
питательной среде, смывают стерильным физиологическим раствором и
9
готовят суспензию клеток в концентрации 1 х 10 КОЕ/куб. см,
используя стандарты мутности, выпускаемые ГИСК им. Тарасевича, или
стандарт McFarlane (N1-7).
Приготовленную 1%-ную взвесь эритроцитов вносят по 1 куб. см в пробирки или по 0,1 куб. см в лунки планшет с U-дном. Далее в тех же количествах вносят суспензию ГММ и взвесь аккуратно перемешивают. Пробирки закрывают пробками, планшет крышкой и помещают в термостат при температуре, оптимальной для исследуемого вида ГММ, на 1 час. После инкубации пробирок или планшета в термостате их вынимают и проводят предварительный учет результатов. При наличии адгезивных свойств у ГММ эритроциты распределяются равномерно по всей поверхности дна. При отрицательном результате все эритроциты собираются в виде точки в середине дна пробирки или лунки планшета. Окончательные результаты исследования учитывают через 18 часов после инкубации пробирок или планшета при комнатной температуре.
4.3.2. Определение адгезивности ГММ, штамма-реципиента и референтного штамма в присутствии D-маннозы
При выявлении выраженной гемагглютинационной активности ГММ или штамма-реципиента ту же реакцию проводят с использованием d-маннозы для определения маннозо-чувствительной или маннозо-резистентной адгезии. Постановка метода в данном варианте проводится аналогично пункту 4.3.1, к которому добавляется ряд пробирок или лунок, в которые внесена 1% D-манноза. В случае маннозо-чувствительной гемагглютинации (адгезии) наблюдается оседание эритроцитов в виде точки в середине дна пробирки или лунки. Маннозо-устойчивая гемагглютинация наблюдается и при добавлении d-маннозы в реакционную взвесь.
При выявлении гемолитической и адгезивной активности у ГММ и штамма-реципиента в экспериментах in vitro необходимы исследования на экспериментальных моделях in vivo.
4.4. Определение вирулентности ГММ, штамма-реципиента
и референтного (контрольного) штамма
4.4.1. Аппаратура, материалы и инструментарий
4.4.1.1. Аппаратура и инструментарий
НД (ГОСТ, ТУ)
Термостат, позволяющий поддерживать
рабочую температуру 28 - 37 °С с
отклонением от заданной +/- 1 °С ТУ 64-1-1382-72
Весы лабораторные общего назначения
2 и 4 класса точности, с наибольшим
пределом взвешивания 200 г ГОСТ 24104-88
Микроскоп биологический МБИ-2, МБИ-3,
МБР-3 ГОСТ 8284-78
Дистиллятор, обеспечивающий качество
дистиллированной воды ГОСТ 6709-72
Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150
или других видов ТУ 16-535-84
Холодильник бытовой электрический
Пинцет медицинский ГОСТ 21241-89
Ножницы медицинские ГОСТ 21239-89
Шприцы медицинские 1 или 0,1 куб. см
Штативы для пробирок
4.4.1.2. Лабораторная посуда и материалы
Бумага фильтровальная лабораторная ГОСТ 12026-76
Марля медицинская ГОСТ 9412-77
Полистироловые планшеты U-образные
Пробирки типов П1, П2 ГОСТ 25336-82
Стекла предметные для микропрепаратов ГОСТ 6672-75
Чашки биологические (Петри) ГОСТ 23932-90
Микробиологические петли
4.4.1.3. Реактивы и питательные среды
НД (ФС, ТУ)
Агар микробиологический ГОСТ 17206-84
Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72
D-глюкоза, ч ГОСТ 6038-79
D-лактоза, 1-водная ТУ 6-09-22-98-79
Натрий фосфорно-кислый однозамещенный, ч ГОСТ 4198-75
Натрий фосфорно-кислый двухзамещенный, хч ГОСТ 2493-75
Кислота соляная, хч ГОСТ 3118-77
Натрий хлористый, хч ГОСТ 4328-77
Спирт этиловый ректификованный технический ГОСТ 18300-87
Спирт этиловый ректификованный ГОСТ 5962-67
Питательный бульон ТУ 10-02-02-789-176-94
Сухая питательная среда для определения
чувствительности к антибиотикам
диффузионным методом ГОСТ 51600-2000
Питательные среды для определения ТУ 9229-072-00419785-97
энтеробактерий ГОСТ 29184-91
Среды для определения дрожжей и ТУ 9229-083-00419785-97
микроскопических грибов (агар Сабуро,
сывороточный и др.) ГОСТ 10444.12-88
Среды для определения S. aureus
(типа Байд-Паркера, солевой агар) ГОСТ 10444.1, п. 5.1,
п. 5.4
Среды для выращивания бифидобактерий,
молочнокислых и пропионово-кислых бактерий
(ГМС, M17, MRS) ТУ 10-02-02-789-192-95
Дезинфицирующий раствор
Микробиологические петли, скальпель
4.4.2. Описание метода
Группам мышей, по 10 животных каждая, вводят внутрибрюшинно по
0,1 куб. см живой культуры ГММ, штамма-реципиента или контрольного
9 7 5 3
штамма в концентрации 1 х 10 , 1 х 10 , 1 х 10 и 1 х 10 КОЕ/куб.
см. Каждую группу животных помещают в отдельную клетку и далее
наблюдают в течение 10 дней за гибелью животных.
В качестве контролей используют группы животных (по 10 шт.), которым внутрибрюшинно вводят: а) стерильный физиологический раствор и б) вирулентный штамм определенного вида с установленной ранее дозой LD50.
4.4.3. Учет результатов
По завершении срока наблюдения подсчитывают гибель животных в каждой группе.
LD50 рассчитывают по формуле:
lgLD50 = lgDN - дельта (SUM Li - 0,5),
где:
N - общее число испытанных доз;
n - число животных, которым введена каждая доза;
дельта - логарифм отношения каждой последующей дозы к предыдущей, т.е. логарифм кратности испытанных разведений;
Li - отношение числа животных, погибших от введения данной дозы, к общему числу животных, которым эта доза введена, индекс i соответствует номеру дозы, если считать наименьшую из испытанных доз первой;
SUM Li - сумма значений Li, найденных для всех испытанных доз;
Di - величина дозы (номер i);
DN - максимальная, D1 - минимальная из испытанных доз.
ГММ и штамм-реципиент считаются авирулентными, если LD50 равна
8
5 х 10 КОЕ/куб. см и более.
При идентичных показателях LD50 у ГММ и штамма-реципиента можно считать, что осуществленная генетическая модификация не повлияла на вирулентные свойства ГММ.
4.5. Определение адгезивности ГММ и штамма-реципиента
in vivo
При подтверждении гемагглютинационной активности ГММ или штамма-реципиента с использованием d-маннозы возможно количественное определение адгезии in vivo при использовании биологических моделей (развивающиеся куриные эмбрионы, энтерально зараженные мыши-сосунки, перевязанная петля тонкого кишечника кроликов). Ниже приведено описание модели для исследования адгезивной активности штаммов микроорганизмов на модели перевязанной петли тонкого кишечника 12 - 14-дневных крольчат.
4.5.1. Материалы и инструментарий
4.5.1.1. Аппаратура и инструментарий
НД (ГОСТ, ТУ)
Термостат, позволяющий поддерживать
рабочую температуру 28 - 37 °С с
отклонением от заданной +/- 1 °С ТУ 64-1-1382-72
Микроскоп биологический МБИ-2, МБИ-3, МБР-3 ГОСТ 8284-78
Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150
или других видов ТУ 16-535-84
Пинцет медицинский ГОСТ 21241-89
Ножницы медицинские ГОСТ 21239-89
Скальпель медицинский хирургический, 15 см ГОСТ 21240-89
Шприцы медицинские 1 или 0,1 куб. см
Штативы для пробирок
4.5.1.2. Животные и штаммы
12 - 14-дневные крольчата
Культура ГММ, штамма-реципиента или
контрольного (референтного) штамма того
же вида, что и ГММ
4.5.2. Сущность метода
В каждый опыт берут не менее 3 крольчат. Животных фиксируют на
специальном столе и внутримышечно во внутреннюю область бедра
вводят тиопентал натрия (0,1 мл 1%-ного раствора на 50 г веса
животного). Наркотический эффект наступает через 2 - 3 минуты. По
средней линии живота крольчонка делают разрез брюшины по 1 см в
обе стороны от пупка. Извлекают петли дистального отдела тонкого
кишечника и в его просвет на расстоянии 3 - 5 см от уровня
верхушки аппендикса, имеющего общую брыжейку с подвздошной кишкой,
вводят с помощью иглы шприца (1,0 куб. см) 0,1 мл микробной
8
взвеси, содержащей 10 КОЕ/куб. см. Одновременно делают 10-кратные
разведения взвеси ГММ и из 3, 4 и 5-го разведений производят
посевы по 0,5 мл на плотную питательную среду, делая параллельные
высевы по 2 чашки Петри на каждое разведение.
Через 1,5 часа после заражения животных усыпляют хлороформом и вскрывают. Отступя 5 - 7 см от слепой кишки, извлекают участок подвздошной кишки длиной 20 см и переносят в чашку Петри. Чтобы предупредить элиминацию ГММ со слизистой кишечника исследуемый материал помещают на лед и дальнейшие процедуры проводят оперативно. Отрезки кишечника разрезают вдоль, трижды промывают в охлажденном при 4 °С растворе 0,9%-ного хлористого натрия, растирают в ступке или специальном гомогенизаторе. К растертой ткани добавляют 1 мл 0,9%-ного раствора хлористого натрия, и полученные суспензии переносят в пробирки, и делают 10-кратные разведения. Из 3, 4, 5-го разведений делают посевы по 0,5 мл на плотную питательную среду, делая параллельные высевы по 2 чашки Петри на каждое разведение. Через 18 - 24 часа после инкубации при температуре, оптимальной для выращивания исследуемого вида ГММ, подсчитывают число выросших колоний, изолированных со слизистой тонкого кишечника и высеянных непосредственно из пробирки до заражения кроликов. Таким образом определяется число ГММ, прикрепившихся к слизистой тонкого кишечника.
4.5.3. Учет и интерпретация результатов
Коэффициент адгезии для количественной оценки адгезивной активности ГММ, штамма-реципиента и контрольного штамма высчитывают по следующей формуле:
в
K = --- x 100%,
а
где:
K - коэффициент адгезии - процент адгезивных ГММ в популяции исследуемого штамма;
а - число жизнеспособных ГММ, введенных в кишечник крольчат;
в - число ГММ, прикрепившихся к стенке кишечника.
По степени адгезивности ГММ они оцениваются следующим образом:
а) высокоадгезивные с коэффициентом адгезии 3,0 и выше, б) адгезивные - от 1 до 3 и в) слабоадгезивные - 0,001 - 0,9. Слабоадгезивные штаммы, как правило, авирулентны, а адгезивные и высокоадгезивные штаммы обычно обладают определенными вирулентными свойствами.
Оценка ГММ осуществляется по двум показателям: 1) он должен иметь коэффициент адгезии не более чем 0,9 и 2) коэффициент адгезии ГММ должен быть равен или быть меньше коэффициента адгезии штамма-реципиента. При показателях коэффициента адгезии выше 1,0 требуются молекулярно-генетические исследования на выявление генов адгезии у ГММ и штамма-реципиента.
4.6. Определение инвазивности ГММ и штамма-реципиента
Инвазивность грамотрицательных бактерий тестируют с помощью кератоконъюнктивальной пробы. Сущность метода заключается в том, что возбудитель проникает в эпителиальные (инвазирует их) клетки конъюнктивы, а затем в роговицу и размножается в них, вызывая очаговое, а затем и сплошное разрушение ткани.
4.6.1. Материалы и инструментарий
НД (ГОСТ, ТУ)
Термостат, позволяющий поддерживать
рабочую температуру 28 - 37 °С с
отклонением от заданной +/- 1 °С ТУ 64-1-1382-72
Пинцет медицинский ГОСТ 21241-89
Ножницы медицинские ГОСТ 21239-89
Скальпель медицинский хирургический, 15 см ГОСТ 21240-89
Микропипетки типа "Ленпипет" переменного
объема 0,5 - 10 мкл, 5 - 40 мкл, 40 - 200
мкл, 200 - 1000 мкл ТУ 9452-002-33189998-02
Наконечники для микропипеток
Шприцы медицинские 1 куб. см или
0,1 куб. см
Штативы для пробирок
4.6.1.1. Животные и штаммы
Морские свинки
Культура ГММ, штамма-реципиента или
контрольного (референтного) штамма того
же вида, что и ГММ
Выращенные на селективной для данного вида микроорганизма
плотной или жидкой питательной среде клетки ГММ и
штамма-реципиента трижды отмывают в стерильной дистиллированной
воде и готовят взвесь по стандарту McFarland или стандартам
8
мутности ГИСК им. Тарасевича в концентрации 1 х 10 КОЕ/куб. см.
0,1 куб. см приготовленной таким образом взвеси вносят в
конъюнктиву глаза. Со второго дня после введения в течение 14 дней
проводят визуальное исследование поражений конъюнктивы и роговицы
глаза. У штаммов, обладающих низкой вирулентностью, поражения
роговицы, носящие обратимый характер, наблюдаются в более поздние
сроки.
Контроль: отрицательный - 0,1 мл в конъюнктиву глаза стерильной дистиллированной воды; положительный - 0,1 мл в конъюнктиву глаза вирулентной культуры возбудителя дизентерии - S. flexneri или S. sonei.
4.6.2. Учет результатов
ГММ, штамм-реципиент и контрольный (референтный) штамм того же вида, что и ГММ, не должны вызывать поражения конъюнктивы и роговицы. В случае выраженных инвазивных свойств выносится отрицательное заключение о возможности использования ГММ в производстве пищевых продуктов.
4.7. Определение антагонистической или симбиотической
активности ГММ и штамма-реципиента с представителями
резидентной микрофлоры кишечника человека
Определение взаимодействия ГММ и штамма-реципиента с резидентной микрофлорой кишечника человека является обязательным для пробиотиков, а также микроорганизмов, входящих как компоненты пищевых продуктов (например, кисломолочная продукция). Для других представителей ГММ данное исследование выполняется по решению экспертного совета, выполняющего микробиологическую и молекулярно-генетическую оценку ГММ и штамма-реципиента.
4.7.1. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды
4.7.1.1. Аппаратура и инструментарий
НД (ГОСТ, ТУ)
Анализатор потенциометрический,
погрешность измерений рН +/- 0,01 ГОСТ 19881-74
Шкаф сушильный стерилизационный ШСС-80П
или других марок, позволяющий поддерживать
температуру (160 +/- 5) °С ТУ 64-1-28-70-76
Термостат, позволяющий поддерживать
рабочую температуру 28 - 37 °С с
отклонением от заданной +/- 1 °С ТУ 64-1-1382-72
Баня водяная с подогревом ГОСТ 12026-76
Весы лабораторные общего назначения
2 и 4 класса точности, с наибольшим
пределом взвешивания 200 г ГОСТ 24104-88
Микроскоп биологический МБИ-2, МБИ-3, МБР-3 ГОСТ 8284-78
Стерилизаторы паровые медицинские
или аналогичные ГОСТ 19569-89Е
Дистиллятор, обеспечивающий качество
дистиллированной воды ГОСТ 6709-72
Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150
или других видов ТУ 16-535-84
Холодильник бытовой электрический
Штативы для пробирок
Микроволновая печь для быстрого плавления
плотных питательных сред
4.7.1.2. Лабораторная посуда и материалы
Бумага фильтровальная лабораторная ГОСТ 12026-76
Бутыли стеклянные для химических реактивов
Марля медицинская ГОСТ 9412-77
Колбы плоскодонные конические или круглые
разной вместимости ГОСТ 1770-74
Воронки стеклянные ГОСТ 25336-82
Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 5556-81
Полистироловые планшеты U-образные
Пробирки типов П1, П2 ГОСТ 25336-82
Стекла предметные для микропрепаратов ГОСТ 6672-75
Термометр ртутный с диапазоном измерения
от 0 до 100 °С (цена деления шкалы 1 °С) ГОСТ 13646-68
Чашки биологические (Петри) ГОСТ 23932-90
Микробиологические петли
4.7.1.3. Реактивы и питательные среды
НД (ФС, ТУ)
Агар микробиологический ГОСТ 17206-84
Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72
D-глюкоза, ч ГОСТ 6038-79
D-лактоза, 1-водная ТУ 6-09-22-98-79
Натрий фосфорно-кислый однозамещенный, ч ГОСТ 4198-75
Натрий фосфорно-кислый двухзамещенный, хч ГОСТ 2493-75
Кислота соляная, хч ГОСТ 3118-77
Натрий хлористый, хч ГОСТ 4328-77
Масло иммерсионное для микроскопии ГОСТ 31739-78
Набор реактивов для окраски по Граму
Спирт этиловый ректификованный технический ГОСТ 18300-87
Спирт этиловый ректификованный ГОСТ 5962-67
Экстракт дрожжевой <*>
Триптон <*>
Антибиотики разных групп <*>
Диски с антибиотиками <*>
--------------------------------
<*> Производства разных фирм, прошедшие государственную
регистрацию и разрешенные к использованию.
Питательные среды:
Для определения количества мезофильных
аэробных и факультативно-анаэробных
микроорганизмов ТУ 9229-083-00419785-97
Питательный бульон ТУ 10-02-02-789-176-94
Питательные среды для определения ТУ 9229-072-00419785-97
энтеробактерий ГОСТ 29184-91
Среды для определения дрожжей и ТУ 9229-083-00419785-97
микроскопических грибов (агар Сабуро,
сывороточный и др.) ГОСТ 10444.12-88
Среды для определения S. aureus
(типа Байд-Паркера, солевой агар) ГОСТ 10444.1, п. 5.1,
п. 5.4
Среды для выращивания бифидобактерий,
молочнокислых и пропионово-кислых бактерий
(ГМС, M17, MRS) ТУ 10-02-02-789-192-95
Планшеты для идентификации культур
производства разных фирм, прошедшие
государственную регистрацию в установленном
порядке и разрешенные к использованию
Реактивы для ряда тестов в зависимости
от идентифицируемого вида ГММ
Стандарт мутности по McFarland
4.7.1.4. Штаммы
ГММ, штамм-реципиент, контрольный
(референтный) штамм того же вида, что и ГММ
Контрольные (референтные) штаммы,
представляющие основные виды резидентной
микрофлоры человека:
Грамположительные облигатно-анаэробные
бактерии
Лактобактерии
Бифидобактерии
Пептострептококки
Грамотрицательные облигатно-анаэробные
бактерии
Бактероиды
Факультативно-анаэробные микроорганизмы
Кишечная палочка
Стафилококки
Стрептококки
Дрожжеподобные грибы рода Candida
Контрольные штаммы, используемые в настоящем разделе, должны иметь паспортные данные и принадлежать к Американской типовой коллекции культур (АТСС) или получены из музея живых культур Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича.
Допускается использование других разрешенных питательных сред и диагностических тест-систем аналогичного назначения для проведения исследований фенотипических свойств в соответствии с данным документом. При их применении необходимо руководствоваться рекомендациями изготовителя.
Питательные среды и биологические препараты импортного производства должны иметь сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000.
Питательные среды и препараты отечественного производства должны соответствовать нормативной документации, утвержденной в установленном порядке.
4.7.2. Сущность метода
Из выращенных на плотных или жидких питательных средах
контрольных штаммов и ГММ, штамма-реципиента и референтного штамма
того же вида, что и ГММ, готовят взвеси микроорганизмов с
определенными концентрациями КОЕ/мл. Далее готовят ряды пробирок с
жидкой питательной средой по 3 мл, на которой способны расти все
исследуемые микроорганизмы (например, триптиказо-соевый или
1 3 5
L-бульон), и вносят по 0,5 мл 10 , 10 и 10 КОЕ/куб. см ГММ и
такое же количество клеток контрольного штамма (например,
Bifidobacterium). Одновременно осуществляют посевы на селективные
питательные среды в разведениях для точного подсчета клеток
каждого вида микроорганизма. Например, для точного подсчета
количества клеток стафилококков посев осуществляется на
желточно-солевой агар при дальнейшем культивировании при 37 °С в
течение 48 часов в аэробных условиях, в то время как для
определения количества клеток бифидобактерий взвесь
микроорганизмов высевается на модифицированную среду Блоурока, а
культивирование производят в анаэробных условиях при 37 °С в
течение 48 часов.
Через 6 и 24 часа осуществляют посевы на селективные питательные среды и подсчитывают число клеток представителя резидентной микрофлоры и ГММ. Контролями служат посевы, в которых выращивается только представитель резидентной микрофлоры или ГММ. Вычисляется число клеток представителя резидентной микрофлоры, выращенного в присутствии ГММ и отдельно. При приблизительно одинаковом соотношении числа выросших клеток отдельно и в присутствии ГММ можно считать, что ГММ не обладает антагонистическим действием. При более высоких показателях числа выросших клеток обоих видов, чем при выращивании каждого из представителей в отдельности, можно констатировать, что оба вида характеризуются симбиотическим действием. При превышении количества клеток представителя резидентной микрофлоры в 5 и более раз, выращенного без ГММ, чем в смеси с ГММ, можно полагать антагонистическое действие ГММ на конкретного представителя нормальной микрофлоры кишечника. В случае, если такое антагонистическое действие ГММ проявляется ко всем или большинству из исследованных представителей нормальной микрофлоры кишечника человека, делается заключение о невозможности его использования в производстве пищевых продуктов. При выявлении антагонистического действия ГММ к 1 - 2 представителям нормальной микрофлоры кишечника человека требуются дополнительные исследования, включающие исследование антагонистической активности ГММ и штамма-реципиента с представителями резидентной микрофлоры кишечника человека in vivo, молекулярно-генетические исследования по выявлению генов, детерминирующих данный феномен.
5. Молекулярно-генетическая оценка ГММ,
используемых для производства пищевой продукции
Необходимость проведения тех или иных исследований по данному разделу и для каждого конкретного вида пищевой проду

ПРИКАЗ МВД РФ от 09.01.2004 n 10 ОБ УТВЕРЖДЕНИИ ИНСТРУКЦИИ О ПОРЯДКЕ ПОЛУЧЕНИЯ, УЧЕТА, ХРАНЕНИЯ И ВЫДАЧИ БЛАНКОВ РАЗРЕШЕНИЙ НА РАБОТУ ИНОСТРАННЫМ ГРАЖДАНАМ И ЛИЦАМ БЕЗ ГРАЖДАНСТВА В ПОДРАЗДЕЛЕНИЯХ ПО ДЕЛАМ МИГРАЦИИ МВД, ГУВД, УВД СУБЪЕКТОВ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ  »
Постановления и Указы »
Читайте также