МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ИНСЕКТИЦИДОВ, АКАРИЦИДОВ, РЕГУЛЯТОРОВ РАЗВИТИЯ И РЕПЕЛЛЕНТОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В МЕДИЦИНСКОЙ ДЕЗИНСЕКЦИИ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУ 3.5.2.1759-03 (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 28.09.2003)


Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
28 сентября 2003 года
Дата введения
с момента утверждения
3.5.2. ДЕЗИНСЕКЦИЯ
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ИНСЕКТИЦИДОВ,
АКАРИЦИДОВ, РЕГУЛЯТОРОВ РАЗВИТИЯ И РЕПЕЛЛЕНТОВ,
ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В МЕДИЦИНСКОЙ ДЕЗИНСЕКЦИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУ 3.5.2.1759-03
1. Разработаны Институтом медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского, кафедрой паразитологии, паразитарных и тропических болезней ММА им. И.М. Сеченова (В.П. Сергиев, Л.А. Ганушкина, В.П. Дремова, Р.Л. Наумов, М.М. Артемьев, И.С. Васильева, В.П. Гутова, А.С. Ершова, Е.А. Черникова); Научно-исследовательским институтом дезинфектологии Минздрава России, кафедрой дезинфектологии ММА им. И.М. Сеченова (М.Г. Шандала, Е.И. Баканова, О.М. Германт, О.Ю. Еремина, М.Н. Костина, Ю.В. Лопатина, В.В. Олифер, Т.А. Перегуда, С.А. Рославцева, А.И. Фролова, Н.А. Хрусталева, Н.И. Шашина); Министерством здравоохранения Российской Федерации (Н.В. Шестопалов, Л.С. Бойко); Федеральным центром государственного санитарно-эпидемиологического надзора (Т.Н. Сыскова, Т.Н. Цыбина); Центром Государственного санитарно-эпидемиологического надзора в г. Москве (Т.Н. Иванова, В.Ф. Негрий), Центром государственного санитарно-эпидемиологического надзора в г. Нижневартовске (Т.М. Гузеева); Центром государственного санитарно-эпидемиологического надзора в г. Нижнем Новгороде (Т.Д. Душина).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Министерстве здравоохранения Российской Федерации (протокол N 19 от 19 сентября 2003 г.).
3. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г. Онищенко 28 сентября 2003 г.
4. Введены впервые.
1. Область применения
Методические указания предназначены для специалистов организаций, занимающихся тестированием и исследованием инсектоакарицидной, рострегулирующей, репеллентной и аттрактивной активности различных веществ и эффективности препаративных форм на их основе, рекомендуемых для целей медицинской дезинсекции.
2. Общие положения
Вновь синтезированные вещества проходят скрининг (отбор). Вещества, поступающие на скрининг, должны быть снабжены паспортом, в котором указаны химическая формула, молекулярная масса, степень чистоты соединения, основные физико-химические параметры, организация, в которой синтезировано соединение.
При изучении препаративных форм дезинсекционных средств должна быть представлена рецептура, в которой указаны все компоненты и их процентное содержание.
2.1. Расчет дозировок и оценка токсичности препаратов
Если инсектоакарицидность веществ для членистоногих неизвестна, исследования проводят в два этапа, если же имеются ориентировочные сведения об уровне инсектоакарицидности, исследования начинают сразу со второго этапа.
На первом этапе для испытания готовят серию из 4 - 5 последовательных 10-кратных разведений испытуемого вещества. Вначале готовят исходный раствор (Cисх.) с концентрацией вещества, необходимой для получения исследуемых концентраций ДВ.
Расчет концентрации исходного раствора (эмульсии, суспензии) проводят по формуле:
A x B
Cисх. = -----, (1)
C
где:
А - необходимая концентрация ДВ;
В - необходимое количество раствора;
С - концентрация ДВ в веществе.
Пример 1. Из вещества, содержащего 90% ДВ, необходимо приготовить 100 мл раствора с концентрацией ДВ 0,3%.
Cисх. = 0,3 x 100 : 90 = 0,33 мл (мг), т.е. к 99,67 мл растворителя необходимо добавить 0,33 мл испытуемого вещества.
Пример 2. Из 50% концентрата эмульсии необходимо приготовить 0,7%-ную водную эмульсию.
Cисх. = 0,7 x 100 : 50 = 1,4 мл.
В том случае, если необходимо приготовить раствор заданной концентрации для обработки определенной площади так, чтобы получить заданную дозировку, производят расчет по формуле 2:
D x S
Cисх. = ---------- x 100%, (2)
Cпреп. x V
где:
Cпреп. - концентрация ДВ в препарате;
Cисх. - концентрация ДВ в исходном растворе;
D - заданная дозировка;
S - площадь обрабатываемой поверхности;
V - объем препарата для обработки этой поверхности.
Пример. Нужно получить дозировку (D) величиной 0,1 г/м при обработке диска из фильтровальной бумаги площадью (S) 78 кв. м (0,0078 кв. м) раствором в объеме (V) 1 мл. Концентрация ДВ в препарате (Cпреп.) - 5% (0,05). Все показатели используют в одной размерности - граммы и квадратные метры или килограммы и гектары. Проценты обозначают десятичной дробью (5% = 0,05).
Расчет: Cисх. = (0,1 x 0,0078) : (0,05 x 1) x 100% = 1,56%.
То есть для получения исходного (рабочего) раствора нужно приготовить 1 мл 1,56% раствора препарата (развести в соотношении 1:63).
Из исходного раствора готовят серию 10-кратных разведений. Для этого к 1 мл исходного раствора добавляют 9 мл растворителя и в результате получают второе разведение; к 1 мл второго разведения добавляют 9 мл растворителя и получают третье разведение и т.д. В нашем примере получаем серию растворов, один мл которых на фильтрах стандартного размера обеспечивает дозировки 0,1, 0,01, 0,001 г/кв. м и т.д.
На втором этапе для исследования препаратов за исходный берут раствор с максимальным разведением, вызвавшим 100%-ную гибель особей в опытах первого этапа, и исследуют серию растворов с нисходящими 2-кратными разведениями.
Для определения СД50(95, 99), СК50(95, 99) используют графический способ вычисления этих показателей на пробит-логарифмической бумаге. На оси абсцисс откладывают дозы ДВ (г/кв. м, мкг/г массы насекомого, мг/особь) или концентрации (%) в последовательных разведениях. На оси ординат - % гибели насекомых при этих дозах (концентрациях). Между полученными точками проводят линию регрессии. Для определения СД50 (СК50) проводят горизонтальную линию на уровне 50% до пересечения с линией графика. Опущенный из точки пересечения перпендикуляр на ось абсцисс покажет по шкале на этой оси искомое значение. Проводя горизонтальную прямую на других уровнях и опуская перпендикуляр, можно определить соответствующие другие значения СД (СК), например для определения СД99 горизонтальную прямую до пересечения с линией графика проводят на уровне 99% и т.д.
Для определения массы 1 членистоногого до опыта взвешивают не менее 10 анестезированных особей (обычно от 10 до 100 особей).
Пересчет концентрации (%) в дозу (мкг/г массы членистоногого) при использовании топикального метода нанесения проводят по формуле:
A x Y x 10000
СД50 = -------------, (3)
B
где:
A - концентрация СК50, %;
Y - нанесенный объем, мкл;
B - масса членистоногого, мг.
Пересчет величин СД50(95, 99) (ЛД50(95, 99)) мкг на 1 мг массы проводят по формуле:
x
ЛД50(99) = - x 1000, (4)
y
где:
x - ЛД50(95, 99) на 1 насекомое в мкг;
y - средняя масса 1 насекомого в мг.
Среднюю величину гибели насекомых вычисляют по формуле:
SUM V
M = -----,
n
где:
V - % гибели в каждом опыте;
n - число повторностей;
SUM - знак суммы.
Для оценки степени достоверности средней величины при данном числе наблюдений используют формулу для подсчета ошибки средней:
___________
/ 2
/SUM (V - M)
/------------
n - 1
m = ---------------,
_
/n
где:
V - каждое измерение;
M - среднее из всех измерений;
n - число измерений;
SUM - знак суммы.
2.2. Расчет инсектицидной активности веществ
и препаративных форм
Инсектицидную активность оценивают по гибели членистоногих в опытах по сравнению с контролем. В зависимости от организации эксперимента возможны 3 варианта оценки инсектицидной активности (формулы 5, 7, 8).
Опыт, при котором членистоногое контактирует с испытуемым веществом, нанесенным на поверхность (или при топикальном нанесении вещества на тело), и в контроле - с растворителем или необработанной поверхностью. В этом случае инсектицидную активность вещества (Y) в каждой повторности оценивают по формуле:
BО Bk
Y = -- x (1 - --) x 100%, (5)
AО Ak
где:
АО и Аk - исходное число особей в опыте и в контроле;
ВО и Вk - число погибших в опыте и в контроле.
Заключительная оценка представляет среднюю величину из всех повторностей опыта.
В случае гибели в контроле 5 - 20% особей к данным опытов вводят поправку по формуле Аббота:
A - B
С = ------- x 100%, (6)
100 - B
где:
А - гибель насекомых в опыте (%);
В - гибель насекомых в контроле (%).
Если гибель особей в контроле превышает 20%, то опыт бракуют. Для получения более надежных оценок препарата исследование следует повторить с более жизнеспособной культурой членистоногих или изменить условия опыта в сторону большей их комфортности для объекта как в контроле, так и в опыте.
Если по каким-то причинам постановка контроля невозможна и об инсектицидной активности приходится судить только по числу (численности) особей до и после применения вещества, формулу 5 упрощают (обозначения те же, что и в формуле 5):
1 - BО
Y = ------ x 100%. (7)

При испытании веществ в природе, когда об их эффективности судят по уменьшению численности объекта на опытном и контрольном участках, расчет проводят по формуле:
At x BО
Y = 100 - ------- x 100%, (8)
AО x Bt
где:
АО - численность объекта в опыте до обработки;
ВО - численность объекта в контроле до обработки;
At - численность объекта через t суток (ч) после обработки в опыте;
Bt - численность объекта через t суток (ч) после обработки в контроле.
Коэффициент отпугивающего действия для насекомых рассчитывают по формуле:
A - B
КОД = ----- x 100%, (9)
A
где:
А - количество насекомых на необработанной поверхности за определенный промежуток времени;
В - количество насекомых на обработанной репеллентом поверхности за такой же промежуток времени.
Коэффициент отпугивающего действия для клещей рассчитывают по той же формуле (9), где А - количество клещей, взятых в опыт; В - количество клещей, прошедших обработанную репеллентом зону.
Ошибку среднего значения инсектицидной активности препарата (и других средних величин) рассчитывают по известной формуле ошибки средней (см. выше). Из-за малого числа повторностей ошибка средней в энтомотоксикологических исследованиях может быть очень велика, особенно в диапазоне около 50%, но при приближении средней эффективности к 100% она снижается. Так, при эффективности препарата в трех повторностях 70, 80 и 90% ошибка составит 7,1%, а при значениях эффективности 85, 90 и 95% - 3,5%.
2.3. Организация экспериментов
На первом этапе на ограниченном количестве видов насекомых устанавливают наличие (или отсутствие) у испытуемых веществ инсектоакарицидных, репеллентных или других свойств. Вещества, у которых такие свойства обнаружены, исследуют по полной схеме второго этапа, которая включает дополнительные методы и расширенный перечень видов членистоногих в зависимости от поставленных задач исследований. На втором этапе проводят более точное определение инсектоакарицидной (или другой) активности веществ. В обоих случаях используют одни и те же методы, описание которых приведено в соответствующих разделах.
Методы определения активности и эффективности дезинсекционных средств при проведении исследований действующих веществ этих средств и препаративных форм при их разработке и изучении и регистрации включают в себя:
- определение специфической инсектоакарицидной, рострегулирующей, аттрактантной, репеллентной и прочих видов активности;
- оценку эффективности дезинсекционных средств в различных препаративных формах, включая аэрозольные и пиротехнические; акарицидных средств для обработки помещений и одежды человека; репеллентных средств для нанесения на кожу и обработки одежды; педикулицидных средств для борьбы с головным, лобковым и платяным педикулезом; акарицидных и инсектицидных средств для применения в природных стациях; регуляторов развития членистоногих; аттрактантов и феромонов при различных режимах применения.
2.4. Характеристика тест-членистоногих,
используемых в опытах
В целях получения сравнимых данных при проведении экспериментов используют стандартные, чувствительные к инсектоакарицидам культуры членистоногих, выращенные в инсектарии. Для опытов отбирают однородные партии членистоногих определенного возраста, пола, питавшихся стандартным кормом. В зависимости от целей экспериментов можно использовать природные популяции членистоногих.
При изучении биологической активности используют, как правило, следующих членистоногих:
Комнатные мухи Musca domestica L.
Имаго самки и самцы 3 - 5-дневного возраста, питавшиеся молоком и сахарным сиропом; личинки - 1 дня III возраста или другого возраста в зависимости от целей экспериментов, развивающиеся во влажных отрубях; яйца свежеотложенные.
Постельные клопы Cimex lectularius L.
Имаго - самки, самцы 5-дневного возраста, накормленные за 3 ч до опыта на морской свинке, кролике или мыши; яйца - 3 - 5-дневные.
Рыжие тараканы Blattella germanica L.
Имаго - сытые самки до выдвижения оотеки, самцы - 3 - 21-дневного возраста; личинки разных возрастов.
Крысиные блохи Xenopsylla cheopis Roth.
Имаго - самки, самцы 5-дневного возраста, накормленные на белых мышах за 3 ч до опыта; личинки II и последнего возрастов.
Платяные вши Pediculus humanus corporis De Geer.
Имаго - самки, самцы 15-дневного возраста, накормленные не ранее чем за 1 ч до опыта; личинки III возраста; яйца - любых возрастов в зависимости от целей эксперимента.
Комары - pp. Anopheles, Aedes, Culex.
Личинки II, III или начала IV возраста, развивающиеся в водопроводной дехлорированной воде, отстоянной в течение 24 ч; имаго - самки 5-дневного возраста, накормленные сахарной водой за 3 ч до опыта.
Платяная моль Tineola bisselliella Humm.
Бабочки и гусеницы 28 - 30-дневного возраста.
Кожеед Attagenus smirnovi.
Имаго и личинки 11 - 12-дневного возраста.
Клещи
Иксодовые - таежный Ixodes persulcatus P. Sch, и лесной I. ricinus L. - активные голодные имаго и нимфы.
Аргасовые - Ornithodoros papillipes (Bir.) - нимфы III и IV возрастов, голодавшие не более 5 - 7 месяцев при комнатной температуре и влажности воздуха 90 - 100%; самки, самцы, голодавшие не более 1 года в тех же условиях (наиболее подходящими в качестве тест-объектов являются нимфы IV возраста).
Гамазовые - крысиный клещ, имаго Ornythonissus bacoti (Hirst).
Чесоточные - самки ушного кроличьего клеща Psoroptes cuniculi (Hering).
Клещи домашней пыли - Dermatophagoides pteronyssinus (Trouessart) и D. farinae (Huges).
При изучении кишечного действия инсектицидов в опытах используют голодных мух, тараканов, которым за 12 ч до опыта дают только воду, но не дают пищи. При изучении репеллентной активности веществ используют голодных имаго блох 2 - 3-недельного возраста и голодных имаго комаров 8 - 10-дневного возраста. При проведении всех экспериментов ставят контрольный вариант (необработанные членистоногие) для оценки состояния биоматериала.
3. Методы оценки инсектицидной и рострегулирующей
активности веществ
3.1. Методы определения инсектицидных свойств
действующих веществ (субстанций)
3.1.1. Метод топикального нанесения инсектицидов
Растворы инсектицидов (спиртовые или ацетоновые) определенного объема с помощью микродозатора наносят на среднеспинку мух, среднегрудь клопов и тараканов. В качестве микродозатора можно использовать микрошприцы, специальные аппликаторы или петли из некорродирующей проволоки. Размер капли должен быть сопоставим с размером членистоногого, но не должен его превышать. Для мух, тараканов и клопов рекомендуется размер капель около 1 мкл.
Петлю можно изготовить самостоятельно из некорродирующего материала (платина, держатель спирали в электролампе) путем наматывания на иглу одного завитка. Форма петли должна быть круглой. Затем в месте соединения петли и стержня делают изгиб под прямым углом и стержень петли прикрепляют к держателю (микробиологический держатель, цанговый карандаш и др.). Петлю калибруют путем перенесения 0,5 мл спирта из маленького стаканчика объемом 1 мл на фильтровальную бумагу с подсчетом количества перенесенных капель. Опыт повторяют не менее 3 раз. Оптимальным является объем петли 1 мкл (0,5 мл = 500 капель).
В опыте используют не менее 5 - 7 концентраций инсектицидов. Параллельно ставят 2 контрольных варианта: в первом на членистоногих наносят растворитель без инсектоакарицида, во втором - насекомых оставляют без обработки (биоконтроль). Все опыты ставят в 3 повторностях, в каждой по 20 особей. В период проведения опытов температура воздуха в помещении должна составлять 21 - 23 °C, относительная влажность - 55 - 60%.
Насекомых после нанесения инсектицида (растворителя) и его высыхания помещают в чистые сосуды: клопов - в пробирки с фильтровальной бумагой, сложенной "гармошкой"; мух и тараканов - в стаканы. Тараканам дают пищу. Сосуды с насекомыми размещают в условиях постоянной температуры (21 - 23 °C) и освещенности или при комнатной температуре и естественной освещенности. Учет результатов опытов для насекомых проводят через 1 сутки. К живым относят особей, способных к направленному передвижению, а особей неподвижных или с резкими нарушениями координации - к мертвым. Если смертность насекомых в контроле составляет более 5%, то в расчеты гибели необходимо вводить поправку по формуле Аббота (6), если смертность выше, то опыт бракуют и повторяют снова, пытаясь выяснить причины неудачи в первом случае.
При проведении экспериментов используют не менее 5 концентраций, которые должны вызывать гибель в интервале 0,1 - 99,9%. Полученные результаты обрабатывают с помощью пробит-анализа, строя кривую регрессии "концентрация -гибель" или "доза - гибель". По кривой регрессии рассчитывают показатели СК50 (ЛД50), СК95 (ЛД95), СК99 (ЛД99) (формулы 3, 4).
При указании данных по летальным концентрациям или дозам необходимо указывать вид насекомого (при возможности пол), стадию развития, происхождение расы или популяции, температуру при проведении экспериментов. Наличие таких сведений позволяет сравнивать данные разных экспериментаторов.
Если перед началом исследований неизвестен диапазон концентраций, вызывающих 100%-ную гибель объекта, то целесообразно поставить ориентировочный опыт с 10-кратным интервалом разведений.
3.1.2. Метод опрыскивания с помощью опрыскивателя с вращающимся столиком (опрыскиватель Поттера)
Применение метода опрыскивания в аппарате типа "Поттера" дает возможность одновременно и равномерно обработать большое количество членистоногих или поверхности водными растворами и эмульсиями.
Опрыскиватель состоит из следующих основных частей: распылитель жидкости, вращающийся столик для размещения биологических объектов, колпак, воздуходувка с мотором для подачи сжатого воздуха. Собственно распылитель изготавливают из латуни, нержавеющей стали или бронзы. Распылитель вставляют в отверстие колпака, воздушный шланг, идущий от воздуходувки, соединяют с распылителем. Колпак обычно делают из стекла или нержавеющей стали с окошком для наблюдения за ходом опрыскивания, высота его 40 - 45 см. Столик опрыскивателя делают вращающимся со скоростью 30 - 40 об./мин. для обеспечения равномерного покрытия поверхности каплями инсектицида. Столик снабжают тарелкой с отверстием посередине и бортиками.
На столик опрыскивателя помещают тест-поверхности или обездвиженных диэтиловым эфиром членистоногих, ставят колпак. Устанавливают на колпак распылитель, в патрубок распылителя заливают отмеренное количество рабочего раствора определенной концентрации инсектицида (например 2,5 мл), включают мотор столика и воздуходувку. Жидкость вытекает через центральную трубку и разбивается конической струей воздуха, проходящей через щели между центральной трубкой и наконечником. Мелкие капли оседают на столик, стенки колпака и опрыскиваемые предметы. Растворы могут быть водными, спиртово-водными или приготовленными на 60%-ном ацетоне, поскольку растворы на чистом спирте или ацетоне слишком сильно испаряются. Количество жидкости, заливаемой в опрыскиватель, подбирается экспериментально, путем сравнения результатов, полученных методом опрыскивания, с результатами, полученными методом топикального нанесения инсектицида откалиброванной петлей или микрошприцем (микродозатором). Обработанных членистоногих после подсыхания на них капель жидкости переносят в сухие чистые стаканы и оставляют для наблюдения и учетов гибели.
3.1.3. Методы принудительного контакта насекомых с обработанными поверхностями
Поверхности разных типов - пластины размером 10 x 20 см из стекла, фанеры, неокрашенной или окрашенной масляной краской, линолеума и других материалов обрабатывают раствором вещества или рабочими жидкостями, изготовленными из препаративных форм (концентраты эмульсий, суспензий, смачивающиеся порошки, флоу, гели и др.). При этом используют градиент концентраций. Одновременно одной концентрацией вещества обрабатывают не менее 3 пластин.
Для обработки поверхностей пластин, не впитывающих жидкость (стекло), используют 50 мл/кв. м рабочей жидкости, для обработки поверхностей, впитывающих жидкость (фанера), - 100 мл/кв. м. Растворы наносят на поверхность путем распыления из распылителя. Контакт насекомых с обработанными пластинами проводят только после полного испарения растворителя с пластин - не ранее чем через 3 ч. При обработке порошками их равномерно распределяют по поверхности кисточкой при норме расхода 3 - 10 г/кв. м. При испытании инсектицидных карандашей (брусков и т.п.) ими обрабатывают стеклянные и фанерные пластинки. Количество ДВ, находящееся на пластинке, вычисляют путем взвешивания пластинки до обработки и после нее. Расчет ДВ проводят на 1 кв. м.
Для контакта насекомых с обработанными пластинами используют два типа экспозиметров:
- Набокова, представляющие собой стеклянный цилиндр высотой 13 - 15 см, диаметром 3,5 - 4,0 см;
- (стеклянные) высотой 8 - 10 см, диаметром 8 - 9 см, применяемые в международной практике для тестирования инсектицидных средств по методу CSMA (Chemical Specialities Manufacturers Association).
На одну обработанную пластину помещают 1 - 2 экспозиметра с насекомыми. Время контакта в экспозиметрах Набокова - 5 - 15 мин. (тараканов и постельных клопов - 15 мин., крысиных блох, комнатных мух и комаров - 5 мин.), в больших экспозиметрах CSMA - 1 ч и более.
Экспозиметры приспосабливают для работы с разными насекомыми. Так, для мух и комаров используют специальный стеклянный поршень, прижимающий насекомых к поверхности, для блох - экспозиметр накрывают влажной многослойной марлевой салфеткой, для экспериментов с тараканами верхний край экспозиметров смазывают вазелином.
Контактирование имаго комаров можно проводить также в пластмассовых экспозиметрах - конусах, рекомендованных ВОЗ для биотестов с обработанными инсектицидами поверхностями. Внутренний диаметр конуса - 85 мм у основания, высота - 55 мм. Конусы сделаны из прозрачного гладкого пластика. В отверстие на вершине конуса запускают самок комаров с помощью стандартного аспиратора с загнутым концом (диаметром 10 мм). Комары остаются в экспозиметре в течение 30 мин. Опыты ставят в 3 повторностях, в каждой используют по 10 насекомых. Опыты сопровождают контролем, в котором насекомые контактируют с поверхностями, обработанными растворителем. Одновременно ставят контроль к биоматериалу.
По результатам опытов высчитывают показатели СК50 (СД50), СК95 (СД95), СК99 (СД99).
Насекомых после контакта с обработанными пластинами переносят в чистые пластиковые стаканы (комаров - в садки) и регистрируют состояние (без внешних признаков паралича, парализованные, мертвые) блох, мух, клопов, комаров в течение 24 - 48 ч, тараканов - 72 - 96 ч. В стакан с тараканами кладут влажный тампон и пищу.
С целью изучения остаточного действия веществ (препаратов) пластины обрабатывают в дозировках (минимальных), которые в предыдущих опытах обеспечивали гибель 99 - 100% насекомых. Обработанные пластинки хранят в горизонтальном положении при комнатной температуре и рассеянном освещении.
Контакт насекомых с обработанной поверхностью проводят раз в 5 - 10 суток до тех пор, пока гибель насекомых составит менее 70%. Тогда поверхность считают утратившей инсектицидные свойства. Длительность остаточного действия выражают в сутках от даты обработки тест-поверхности.
3.1.4. Метод свободного контакта насекомых
Этот метод позволяет более полно оценить инсектицидный препарат с учетом степени его репеллентности. Опыты с тараканами проводят в специальных полигонах площадью не менее 0,2 кв. м (40 x 50 см) и высотой бортов 12 - 20 см, края которых смазаны вазелином. В центре полигона помещают пластинку (стекло, фанера) размером 10 x 10 см, верхняя сторона которой обработана инсектицидом в определенной выбранной дозе, обеспечивающей 50, 95 или 99% гибели тараканов в опыте с принудительным контактом. По углам этой пластинки располагают прокладки высотой 15 мм и сверху накрывают чистыми фанерными пластинками того же размера. Таким образом получается укрытие для тараканов.
В каждый полигон помещают 120 тараканов при соотношении самок, самцов и личинок II - IV возраста 1:1:4. В полигоне расставляют сосуды с водой и кормом (белый хлеб). Опыты ставят не менее чем в 3 повторностях. Учет погибших насекомых проводят каждые 24 ч в течение 3 - 5 суток или более в зависимости от целей эксперимента и изучаемого средства.
Опыты на мухах проводят в стеклянных камерах объемом 1 куб. м, имеющих затянутые марлей "окна" для проветривания. В каждую камеру помещают по 300 особей мух обоего пола в соотношении 1:1 и сосуд с 10%-ным сахарным сиропом. Камеру снаружи освещают электролампой (60 Вт). В верхней части камеры подвешивают ленты или пластинки, обработанные инсектицидом в дозах, обеспечивающих 50, 95 и 99% гибели мух в опытах с принудительным контактированием. Жидкие препараты в чашке Петри помещают на дно камеры.
Каждый вариант опыта и контроль ставят не менее чем в 3 повторностях. Учет погибших насекомых проводят через 24 ч. Эффективность препарата в каждом варианте опыта оценивают по формуле (5).
3.1.5. Изучение овицидного действия инсектицидов
3.1.5.1. Изучение овицидного действия инсектицидов по отношению к мухам
При определении овицидности препаратов для яиц мух можно использовать два метода. При первом методе 20 мг яиц комнатных мух помещают на влажные отруби в 0,5-литровые сосуды. Для приготовления влажных отрубей берут на 100 г прокаленных 200 г воды и тщательно перемешивают. В каждый сосуд помещают 200 г влажных отрубей, поверхность субстрата с яйцекладками равномерно орошают 10 мл раствора (эмульсии, суспензии) инсектицида, что соответствует норме расхода рабочей жидкости 1 л/кв. м. Дозу препарата рассчитывают по ДВ на 1 кг субстрата. Опыты ставят одновременно не менее чем в 5 дозах, каждая в 3 повторностях. В контрольном варианте яйцекладки орошают водой или растворителем. После орошения яйцекладки засыпают тонким слоем (1,0 - 1,5 см) влажных отрубей, чтобы предотвратить их высыхание. Сосуды завязывают салфетками из бязи.
При втором методе на пластинки черной бумаги (1 x 1 см), слегка смоченные молоком или белком куриных яиц, кисточкой или препаровальной иглой наносят по 20 жизнеспособных яиц. Пластинки с яйцами погружают на 3 с в спиртовые или водные рабочие растворы препаратов или действующих веществ; контрольные - в чистый спирт или воду, подсушивают на фильтровальной бумаге и переносят в чашки Конвея, в которых круговые емкости заполнены водой для поддержания 100%-ной влажности. Для нахождения величин СК50 и СК95 используют не менее 5 - 6 концентраций в 5 - 7-кратной повторности.
Учет результатов проводят через 48 ч, подсчитывая число личинок, выплодившихся из контрольных и обработанных яйцекладок. Эффективность препарата устанавливают по соотношению числа личинок в обработанном и контрольном субстрате. Определяют дозу (концентрацию), обеспечивающую 50 и 99% гибели яиц.
3.1.5.2. Изучение овицидного действия инсектицидов по отношению к клопам
Яйцекладки 3 - 5-дневного возраста, помещенные на листы фильтровальной бумаги размером 30 кв. см, орошают 0,3 мл раствора (эмульсии, суспензии) инсектицида. Каждый инсектицид испытывают не менее чем в 5 концентрациях, в 3 повторностях каждая. Дозу инсектицида по ДВ рассчитывают в граммах на 1 кв. м обработанной поверхности. В контроле яйцекладки обрабатывают водой или растворителем. После обработки яйцекладки переносят в стеклянные стаканы и сверху покрывают нарезанной фильтровальной бумагой.
Учет результатов проводят через 5 - 7 суток. Эффективность препарата определяют по соотношению числа личинок, вылупившихся из обработанных и контрольных яйцекладок. Определяют дозу (концентрацию), обеспечивающую 50, 95 и 99% гибели яиц.
3.1.5.3. Изучение овицидного действия инсектицидов по отношению к блохам
На дно трехлитрового сосуда кладут листы черной бумаги так, чтобы она полностью покрывала дно сосуда, и помещают туда белую мышь в сетчатой клетке. На зверька выпускают 100 самок и 25 самцов блох. Листы бумаги меняют ежедневно и подсчитывают количество отложенных на них яиц. Из листа, на котором отложены яйца блох, вырезают листки размером 4 x 5 см и обрабатывают каждый 0,2 мл раствора (эмульсии) инсектицида. Опыты ставят в 5 концентрациях, в 3 повторностях каждая. В контрольном варианте лист бумаги обрабатывают растворителем.
Опыты с яйцекладками насекомых проводят при температуре воздуха в помещении 23 - 27 °C. Учет результатов проводят через 4 - 6 суток. Эффективность обработки определяют по соотношению числа личинок, выплодившихся на обработанном и контрольном листах. Определяют дозу (концентрацию), обеспечивающую 50, 95 и 99% гибели яиц.
3.1.6. Методы изучения инсектицидной активности веществ на преимагинальных стадиях мух
3.1.6.1. Обработка субстрата, в котором находятся личинки
В сосуды объемом 0,5 л с 200 г влажных отрубей помещают на поверхность субстрата 30 личинок III возраста. Когда все личинки проникнут в субстрат (через 10 - 15 мин.), из распылителя равномерно орошают поверхность 10 мл раствора (эмульсии, суспензии) инсектицида, что соответствует 2 л/кв. м рабочей жидкости. Сосуды закрывают бязевыми салфетками, которые закрепляют резинками. В каждом опыте используют 5 концентраций инсектицида в 3 повторностях. В контроле субстрат с личинками орошают растворителем.
Учет результатов проводят через 48 ч, подсчитывая число личинок, погибших в 3 сосудах, живых личинок оставляют в субстрате до окончания метаморфоза. Эффективность препарата определяют по процентному соотношению числа погибших личинок и выплодившихся имаго в контроле и опыте. Определяют концентрацию, обеспечивающую 50, 95 и 99% гибели личинок (формула 5).
3.1.6.2. Обработка субстрата до подсадки личинок
Влажные отруби обрабатывают раствором (эмульсией, суспензией) инсектицида из расчета 50 мл на 1 кг субстрата и тщательно перемешивают. В каждые 200 г обработанного субстрата подсаживают 30 личинок III возраста. В каждом опыте используют 4 концентрации инсектицида в 3 повторностях. В контроле субстрат обрабатывают растворителем. Учет результатов проводят через 24 и 48 ч после постановки опыта. Оставшихся в живых личинок пересаживают через 2 суток в необработанные отруби и наблюдают за циклом метаморфоза - подсчитывают число куколок и выплодившихся имаго.
Эффективность препарата определяют по соотношению числа личинок и выплодившихся имаго в контроле и опыте (формула 5). При подсчете результатов опытов рассчитывают дозировку по ДВ на 1 кг субстрата и определяют концентрацию, обеспечивающую 90, 95 и 99% гибели личинок.
3.1.7. Изучение действия инсектицидов на куколок мух
По 10 - 20 куколок комнатных мух помещают на дно стеклянных сосудов и засыпают слоем песка высотой 6 - 7 см, затем с помощью распылителя обрабатывают песок водными эмульсиями (растворами, суспензиями) препарата из расчета 1 л раствора на 1 кв. м. Обработку проводят 5 - 7 концентрациями препарата, каждый опыт ставят в 3 повторностях. Сосуды с куколками обвязывают марлевыми салфетками либо ставят открытыми в марлевый (сетчатый) садок. Подсчет выплодившихся мух проводят через 2 - 3 - 5 суток после обработки. Одновременно ставят контроль - сосуды с куколками, обработанными растворителем (водой). Эффективность препарата определяют по процентному соотношению числа мух, выплодившихся в контроле и опыте (формула 5). Определяют концентрации, обеспечивающие 50, 95 или 99% гибели мух.
3.1.8. Изучение фумигационного действия инсектицидов
Опыты проводят в сосудах емкостью 1 л. На стенках внутри сосуда помещают фильтровальную бумагу (10 x 20 см), предварительно пропитанную 2 мл ацетонового (спиртового) раствора препарата и просушенную при комнатной температуре не менее 20 мин. При использовании сосудов большего объема размер бумаги соответственно увеличивают. Расчет препарата проводят в г/куб. м по ДВ. К крышке сосудов подвешивают садок из металлической сетки на расстоянии 10 см от дна. В садок помещают комнатных мух, тараканов или постельных клопов (не менее 10 насекомых). В опытах используют серии концентраций в 3 повторностях.
Подсчет погибших насекомых осуществляют через 3 - 6 - 24 ч. Расчет эффективности проводят по формуле (5). Определяют концентрации, которые обеспечивает 50, 95 и 99% гибели насекомых.
3.1.9. Изучение кишечного действия инсектицидов
3.1.9.1. Метод группового кормления мух
Раствором инсектицида в 10%-ном сахарном сиропе (50 мл) пропитывают кусочки ваты массой 1 г, которые размещают тонким слоем на дне чашек Петри. При изучении веществ, нерастворимых в воде, готовят 10% спиртовой раствор, а затем разбавляют его сахарным сиропом до нужной концентрации. Испытания инсектицидов проводят в концентрациях 0,001; 0,01; 0,1; 1,0%, в каждой не менее 3 повторностей. В марлевый садок размером 20 x 20 x 20 см помещают чашку Петри с испытуемым веществом (отравленной приманкой), в качестве альтернативной пищи ставят сосуд с молоком. При изучении эффективности сухой сахарной приманки (40 - 60% сахара) ее наносят на пластинки из стекла или фанеры, которые помещают в садок. В опытах используют 30 мух обоего пола 3 - 5-дневного возраста. За 12 ч до опыта в садках, в которых выращивают мух, оставляют только воду. Контролем служат мухи, питавшиеся молоком. Подсчет погибших мух проводят через 3, 24 и 48 ч. Эффективность инсектицида определяют по числу мух, погибших в опытных и контрольных садках (формула 5). Определяют концентрации, которые обеспечивают 50, 95 или 99% гибели мух.
3.1.9.2. Метод группового кормления тараканов
Приготавливают растворы (эмульсии, суспензии) инсектицида в подсолнечном масле или воде (в 4 - 5 концентрациях) и наносят по 1,5 мл на кусочки пшеничного хлеба размером 2 x 1 x 1 см. Опыты ставят одновременно со всеми концентрациями, в 3 повторностях каждая. Хлеб, смоченный инсектицидом, помещают на подложке из полиэтилена (целлофана) в сосуд диаметром около 30 см и высотой около 10 см. Края сосуда смазывают изнутри вазелином, чтобы предотвратить выползание тараканов. В сосуд помещают по 30 насекомых (самки, самцы, личинки II - IV возрастов) в соотношении 1:1:4. В качестве альтернативной пищи кладут необработанный инсектицидом кусочек пшеничного хлеба и тампон, смоченный водой. В контроле используют хлеб, смоченный растворителем (масло, вода). Одновременно ставят контроль к биоматериалу.
Учет гибели тараканов проводят ежедневно в течение 5 суток. Критерием оценки кишечного действия инсектицида является число выживших насекомых через 5 суток от начала опыта в сравнении с контролем (формула 5). Рассчитывают концентрации, вызывающие 50, 95 или 99% гибели насекомых.
3.1.9.3. Метод дозированного кормления насекомых
Метод предусматривает кормление насекомых из микропипетки с оттянутым концом водными растворами (эмульсиями), приготовленными на 10%-ном сахарном сиропе. Метод позволяет точно регулировать количество раствора, выпиваемого насекомыми, путем прерывания кормления в нужный момент.
При постоянном объеме раствора (для комнатных мух - 0,01 мл, рыжих тараканов - 0,05 мл) дозу инсектицида варьируют путем изменения концентрации ДВ. Перед кормлением мух выдерживают без питания 12 ч, тараканов - 2 суток. В контрольных опытах насекомых кормят сахарным сиропом или растворителем. Опыты ставят в 3 повторностях для каждой концентрации, в каждой повторности используют не менее 10 насекомых.
За процессом отмирания комнатных мух наблюдают в течение 1 суток, тараканов - в течение 3 - 5 суток. Критерием оценки эффективности инсектицида служит величина ЛД50(99), выраженная в мкг на одно насекомое или в мкг на 1 г массы насекомого (формулы 3, 4).
3.1.9.4. Изучение ларвицидного действия инсектицидов по отношению к личинкам комаров
В сосуды объемом 0,5 л (стеклянные сосуды, полистироловые или парафинированные стаканы и т.п.) наливают по 249 мл водопроводной воды, отстоянной в течение 24 ч. В каждый сосуд (за 2 ч до опыта) помещают по 25 личинок III или начала IV возраста. Через 2 ч погибших или ослабленных личинок удаляют и заменяют на жизнеспособных. В сосуды добавляют 1 мл раствора (эмульсии, суспензии) инсектицида определенной концентрации. Одновременно испытывают 4 - 5 концентраций, каждая в 3 повторностях. Контролем служат личинки, находившиеся в воде без добавления инсектицида. Параллельно ставят контроль с эталонным препаратом. В период эксперимента температура воды должна находиться в пределах 21 - 23 °C.
Подсчет погибших личинок проводят через 24 ч. Если более 10% личинок в контроле окуклилось, опыт не учитывают и повторяют.
Испытания бактериальных препаратов проводят следующим образом: 50 мг препарата (порошок) помещают в 20 мл флакон, добавляют 10 мл дистиллированной воды и 15 стеклянных шариков диаметром 6 мм. Содержимое гомогенизируют 10 мин. в шейкере при скорости 700 ударов в мин. Затем 0,1 мл гомогената смешивают с 9,9 мл дистиллированной воды. Из этой суспензии делают последующие разведения. Для этого в сосуды, содержащие 150 мл дистиллированной воды, добавляют 120, 90, 60, 30 и 15 мкл исходной суспензии, получая концентрации 0,04, 0,03, 0,02, 0,01 и 0,005 мг/л соответственно. В каждый сосуд подсаживают по 25 личинок комаров начала IV возраста. Опыты проводят в 3 повторностях. В контроле личинок помещают в дистиллированную воду. Опыты проводят при температуре 23 - 27 °C. Гибель личинок определяют через 24 и 48 ч.
По другой методике опыты проводят в чашках Петри с диаметром 80 - 100 мм, объем суспензии препарата - 50 мл. При разведении препарата соседние концентрации отличаются в 4 раза (шкала с шагом 4). В каждый сосуд помещают 20 личинок комаров II возраста и выдерживают при 27 °C в течение 23 ч. Высчитывают эффективные концентрации, обеспечивающие гибель 99 - 100% личинок.
3.1.10. Изучение раздражимости комаров
Раздражимость комаров может быть вызвана не только самим инсектицидом, но и другими компонентами, входящими в состав испытываемой формы. Раздражимость крайне важна при работе с эпидемиологически опасными малярийными комарами, поскольку способствует перелету комаров из обработанных помещений (хлева, надворные постройки) в необработанные (жилые помещения). Риск заражения малярией при этом многократно увеличивается.
Для определения раздражимости рекомендуется предложенный ВОЗ метод с усовершенствованиями, внесенными ИМПиТМ. Фильтровальную бумагу обрабатывают из пульверизатора рабочим раствором инсектицида в концентрации, отобранной в первичном опыте. Исследования проводят через 1 - 2 суток после обработки.
Аппарат для определения раздражимости представляет собой светонепроницаемую камеру из легкого дерева размером 135 x 135 x 90 мм. Свет проникает в нее сквозь круглое отверстие в задней стенке диметром 90 мм, по бокам которого имеются пазы для матового стекла с нанесенным на него инсектицидом (или контрольного) и конического экспозиметра (те же конусы, что и для определения продолжительности действия инсектицида). Опыты проводят в темной комнате с единственной электрической лампочкой, помещаемой перед задней стенкой прибора на расстоянии, зависящем от мощности лампы: 40 Вт - 41 см, 60 Вт - 55 см, 100 Вт - 92 см. Комаров в садке перед опытом содержат в той же комнате при том же освещении (т.е. расстояние от лампы) в течение 0,5 - 1 часа. Каждого комара (сытых самок) сначала сажают в контрольный экспозиметр (та же бумага, но без инсектицида), где выдерживают 3 мин., а затем в течение 10 мин. подсчитывают число взлетов. Комары, взлетевшие в контроле 2 и более раз, выбраковываются как спонтанно раздражимые. Причиной спонтанной раздражимости могут быть травмы комаров при пересадке или неблагоприятные условия (при массовой раздражимости). Спокойных комаров (не было взлетов или 1 случайный взлет без ползания по бумаге) по одному пересаживают в опытный экспозиметр с бумагой, обработанной инсектицидом, и после 3 мин. начинают подсчет взлетов, продолжающийся 10 мин. Отмечают также "хождение" комара по бумаге, что также говорит о раздражимости.
В опыте должно быть использовано не менее 50 особей. По окончании опыта подсчитывают распределение особей по степени раздражимости.
Для подвальных комаров C. pipiens опыты по раздражимости также важны, поскольку при некачественной обработке (с огрехами) комары, обладающие раздражимостью, выбирают для посадок необработанные инсектицидом места.
3.2. Методы изучения активности веществ по отношению
к иксодовым и аргасовым клещам
Оценку акарицидной активности проводят на активных нетравмированных самках видов клещей, являющихся основными переносчиками возбудителей эпидемически значимых инфекций.
Испытания на иксодовых клещах предпочтительно проводить в весенне-летний период и использовать самок природной популяции, собранных с растительности не более чем за сутки до проведения опытов и хранившихся в пробирках дифференцированной влажности или во влажных бинтах при температуре 12 +/- 2 °C. Возможно использование самок лабораторного разведения после проверки их двигательной активности и агрессивности. Самки таежного клеща при температуре 22 +/- 2 °C должны за 2 мин. проходить на контрольном тесте (ленте) путь 25 - 30 см, следуя за пальцем экспериментатора.
3.2.1. Методы топикального нанесения акарицидов на клещей
С помощью микродозатора 0,3 мкл раствора исследуемого вещества наносят на спинную поверхность клеща. Используют не менее 4 концентраций, в каждом варианте по 20 клещей. В контроле на клещей наносят растворитель в том же объеме.
Если токсичность препарата для клещей не известна хотя бы приблизительно, ставят ориентировочный опыт. Готовят 4 - 5 10-кратных разведений препарата и на каждое разведение используют по 10 клещей. Для более точного определения акарицидной активности берут то максимальное разведение (минимальную концентрацию), которое вызвало 100%-ную гибель клещей в ориентировочном опыте, и из него готовят 5 2-кратных разведений. Каждое из 2-кратных разведений испытывают не менее чем на 20 клещах. В опыте используют клещей одного пола, желательно самок. Если использованы клещи обоих полов, то оценку токсичности проводят для самцов и самок отдельно. После высыхания раствора иксодовых клещей помещают в пробирки дифференцированной влажности и содержат при комнатной температуре и естественном освещении, аргасовых клещей - в пробирки с полоской фильтровальной бумаги, сложенной гармошкой, и содержат в специальных шкафах, в которых для поддержания высокой влажности (около 90%) стоят стаканы с водой, или в коробках, прикрытых влажным полотенцем.
Учет результатов проводят на 5 сутки для иксодовых клещей и через 5 - 15 суток - для аргасовых. При анализе результатов опытов методом пробит-анализа вычисляют показатели СД50 и СД99 в мкг на одну особь.
3.2.2. Методы принудительного контакта клещей с обработанной поверхностью
Контактирование иксодовых клещей с обработанными поверхностями проводят используя фильтровальную бумагу. Бумагу в виде круга диаметром 10 см (на 1 см больше диаметра стандартной чашки Петри), площадью 78 кв. см размещают горизонтально на невпитывающей поверхности (стекло, керамическая плитка и т.д.) и с помощью пипетки равномерно наносят на нее раствор изучаемого вещества в ацетоне (серия концентраций - не менее 5) из расчета 1 мл раствора на 100 кв. см или 0,78 мл на круг. В контрольном варианте на круги такой же бумаги наносят тем же способом растворитель. После испарения растворителя фильтры помещают на дно чашек Петри так, чтобы края слегка загибались на стенки чашки. Продолжительность контакта клещей с бумагой 10 мин. Клещей, выползающих за пределы круга, кисточкой возвращают на бумагу. Поскольку клещи достаточно подвижны, одновременно в чашку Петри целесообразно помещать не более 2 - 3 особей. Контакт с каждой концентрацией проводят в 3 повторностях по 10 клещей в каждой при комнатной температуре. В контроле, едином на весь опыт, также 3 повторности по 10 клещей. Все работы с контрольными клещами должны быть проведены на отдельном столе с использованием незагрязненных инструментов (ножниц, кисточек и т.д.). Работы с разными концентрациями необходимо начинать с меньших. Сразу после контакта клещей кисточкой переносят в пробирки дифференцированной влажности (по 10 особей в пробирку), которые размещают горизонтально в условиях комнатной температуры и естественной освещенности. Учет результатов опыта проводят ежедневно в течение 5 суток. К живым относят особей, способных к передвижению, к категории "мертвые" - неподвижных клещей, не реагирующих на тепло руки и дыхание (обычно у мертвых клещей раздвинуты пальпы), а также слабоподвижных клещей с резкими нарушениями координации. Если смертность клещей в контроле составляет более 5%, то в дальнейшие расчеты необходимо вводить поправку по формуле Аббота. Полученные данные обрабатывают с помощью метода пробит-анализа.
Контактирование аргасовых клещей проводят по той же методике. Эти клещи плохо передвигаются по стеклянной вертикальной поверхности и крайне редко заползают на стенки, поэтому всех особей одной повторности запускают в чашку одновременно. Продолжительность контакта 30 - 60 мин. Для препаратов с низкой акарицидной активностью экспозицию увеличивают до 2 - 4 ч. Гибель клещей отмечают на 5 и 15 дни после контакта. Учет гибели, как у иксодовых клещей.
На основании результатов проверок высчитывают СК50 и СК99. Акарицидную активность препарата в каждом разведении определяют по формуле (5).
Для установления длительности остаточного действия препаратов используют фильтр, импрегнированный в минимальной дозировке, вызвавшей 100%-ную гибель клещей в предыдущем опыте. Обработанные единовременно фильтры хранят при комнатной температуре так, чтобы они не соприкасались. Контакт клещей проводят впервые через неделю после импрегнирования бумаги и далее еженедельно в течение месяца, а затем с месячными интервалами до тех пор, пока доля погибших клещей не достигнет 70% или менее. Для каждого контакта используют новый фильтр. Учет результатов проводят, как в основном опыте. Продолжительность остаточного действия препарата выражают в сутках со дня обработки бумаги до времени регистрации 70%-ной смертности.
3.2.3. Определение скорости наступления состояния нокдауна и высоты подъема клещей по обработанной ткани
Тест для опытов готовят следующим образом. На ленте из хлопчатобумажной бязи размером 10 x 70 см карандашом наносят отметки длины от 0 до 60 см, причем первая (нулевая) отметка делается на расстоянии 10 см от края. На участок ленты, размещенной горизонтально на невпитывающей поверхности (стекло, керамическая плитка и т.д.), начиная от отметки 0 до 10 (площадь обрабатываемого участка 100 кв. см) из пипетки равномерно наносят 1 мл 1%-ного ацетонового раствора изучаемого вещества. Контрольный тест обрабатывают аналогично, используя ацетон. После испарения растворителя тесты развешивают в лаборатории в одинаковых контролируемых условиях температуры, влажности и освещенности. Опыты проводят в день обработки. Тесты закрепляют под углом 70°. Клещей по одному помещают на 5 см ниже нулевой отметки и наблюдают за их передвижением вверх по ткани, дополнительно стимулируя их пальцем наблюдателя, который держат на расстоянии 0,5 см от гипостома клеща. С помощью секундомера регистрируют время от момента пересечения клещем нижней черты обработанного участка до отпадения клеща с теста, что соответствует времени наступления состояния нокдауна (ТН, мин. или КТ, мин.). Отпавших клещей фиксируют в 70%-ном растворе этилового спирта или продолжают дальнейшее наблюдение за ними. Опыт проводят не менее чем с 30 самками. Рассчитывают среднее значение времени наступления состояния нокдауна ТНср. в минутах и статистическую ошибку.
Одновременно с определением THср. регистрируют максимальную высоту подъема клеща по тесту (MB, см). Рассчитывают среднее значение показателя MBср. в сантиметрах и статистическую ошибку.
3.2.4. Определение скорости присасывания клещей, контактировавших с исследуемыми веществами
На тщательно выстриженную спину лабораторного кролика коллодием или другим не токсичным для кожи клеем приклеивают 4 стеклянных цилиндра (диаметр 3 см, высота 4 см) с отогнутыми краями. Один из них является контрольным, а три - опытными. Сначала в контрольный цилиндр запускают 5 самок, ползавших до этого в течение 2 мин. на необработанном (контрольном) тесте. Верхнее отверстие цилиндра затягивают мелкосетчатым материалом, закрепляя его резиновым кольцом. В каждый из опытных цилиндров запускают по 5 самок сразу после их контакта с обработанной поверхностью. Продолжительность контакта должна составлять половину ТHср. Время от запуска до присасывания каждой самки к кролику регистрируют с помощью секундомера. Контроль и опыт повторяют трижды. Рассчитывают среднее значение времени присасывания самок в контроле, опыте и отношение этих показателей, которое называется индексом скорости присасывания (ИСП).
Vk
ИСП = --,

где:
Vk - средняя скорость присасывания клещей в контроле, мин.;
VО - средняя скорость присасывания клещей в опыте, мин.
Методы изучения акарицидной активности веществ по отношению к другим группам клещей - гамазовым, чесоточным, клещам домашней пыли - представлены в главе 5.
3.3. Методы изучения регуляторов развития насекомых
3.3.1. Общие сведения
Группа регуляторов развития насекомых (РРН) объединяет соединения, являющиеся по механизму действия аналогами природных гормонов насекомых: ювенильного (АЮГ или ювеноиды), личиночного (ЛГ или экдизоиды), нейрогормонов и ряда других. В эту группу входят также химические соединения, не являющиеся по структуре аналогами природных гормонов, но вызывающие у насекомых гормоноподобные эффекты. К ним относятся ингибиторы синтеза хитина (ИСХ): хлор- и фторпроизводные мочевины (дифлубензурон, тримфлумурон, гексафлумурон и др.). Из группы аналогов ювенильного гормона в нашей стране наиболее известны метопрен, гидропрен и пирипроксифен, из группы ИСХ - димилин.
Для характеристики активности АЮГ и ИСХ используют величины эффективных концентраций и доз, вызывающие морфогенетические или прочие изменения у 50, 95 или 99% членистоногих.
3.3.2. Тип действия
Механизм действия АЮГ заключается в том, что введение экзогенного аналога в тот период, когда титр истинного гормона в организме насекомого минимален ("критический период"), вызывает эффекты, отсутствующие при нормальном прохождении метаморфоза. Поскольку эти соединения являются аналогами природных гормонов, организм реагирует на их появление (присутствие) образованием промежуточных особей, гигантских, сильно меланизированных личинок, недоразвитых куколок с развитой головой имаго и т.п.
Ингибиторы синтеза хитина - это соединения, которые ингибируют процесс образования глюкозы, необходимой для синтеза хитина. Из-за ее отсутствия ослабляется связь между эндо- и экзокутикулой и насекомое не может завершить процесс окукливания.
3.3.3. Проявление гормоноподобного действия
Проявлением гормоноподобного действия ИСХ является отсутствие куколок и различные нарушения линьки на протяжении всего цикла развития от яйца до начала окукливания. Появление куколок свидетельствует об окончании срока действия ИСХ.
При воздействии АЮГ отмечаются нарушения морфогенеза на протяжении всего цикла развития, отсутствие вылета (выплода) имаго, появление неполноценных имаго или особей с признаками предшествующей фазы развития - "адультоидов".
Фаза яйца. Воздействие АЮГ на процессы эмбриогенеза заключается в ингибировании дифференциации клеток и тканей и может проявляться в гибели эмбрионов на разных стадиях развития внутри яйца или в отрождении уродливых нежизнеспособных личинок. Видимые нарушения эмбриогенеза могут быть вызваны как путем нанесения АЮГ непосредственно на яйцо, так и путем обработки самок в период, предшествующий яйцекладке. Воздействие препаратов на свежеотложенное яйцо (20 - 30 ч после откладки) препятствует нормальному развитию эмбриона, приводя его к гибели. В более поздние сроки после откладки, когда процесс эмбриогенеза уже завершен и в яйце происходят процессы личиночной дифференциации, обработка уже не препятствует отрождению личинок. Однако личинки могут иметь нарушения линьки, образовывать промежуточные формы и погибать при линьке на имаго.
ИСХ в отличие от АЮГ не блокируют эмбриогенез: из яйца развивается личинка, которая погибает на стадии очередной линьки или при формировании куколки.
Фаза имаго. АЮГ не рекомендуется для использования в отношении имаго мух: вместо ожидаемого эффекта подавления численности они повышают яйцепродуктивность самок в 1,5 - 2 раза в сравнении с контролем. У имаго тараканов они вызывают эффект стерилизации и резко выраженные морфогенетические эффекты: деформированные или укороченные крылья, смазанный рисунок жилкования, промежуточные формы сильно меланизированные, редукция члеников конечностей, недоразвитые отеки. У блох наблюдается эффект стерилизации у самок при воздействии ИСХ и нарушения при формировании кокона при воздействии АЮГ.
ИСХ обладают стерилизующим действием на имаго мух при скармливании им приманок. Эффект выражается в частичной или полной нежизнеспособности отложенных яиц или в полном отсутствии кладок.
Фаза личинки. В процессе онтогенеза насекомых периоды очень высокой чувствительности к АЮГ чередуются с периодами полной нечувствительности к его действию. Поэтому получить видимые эффекты от применения АЮГ возможно лишь в отдельные моменты развития, когда титр природного гормона в гемолимфе снижается до критического уровня или гормон отсутствует вообще. В это время организм наиболее чувствителен к АЮГ - это и есть "критический период", во время которого и следует проводить испытания АЮГ. Учитывая, что "критический период" у АЮГ - это личинка последнего возраста, для получения достоверных результатов необходим строго выровненный биологический материал, отличающийся по возрасту в пределах от нескольких часов до 1 суток.
Фаза куколки. ИСХ и АЮГ слабо проникают через пупарий, поэтому этот метод испытания не рекомендуется, поскольку для получения очень слабого эффекта концентрации приходится увеличивать в 3 - 5 раз по сравнению с теми, которые использовали для обработки личинок.
В целом отличие испытаний РРН от инсектицидов касается работы с личинками мух и комаров (блох - в меньшей степени), где необходимо учитывать "критический период", т.к. воздействие вещества можно просто "не поймать". При работе с тараканами и в меньшей степени с блохами, имеющими сухопутную (воздушную) среду для развития и имаго, и личинок, методы испытаний почти не отличаются по сути; различны лишь методы оценки эффективности и сами получаемые эффекты.
3.3.4. Тест-объекты и постановка экспериментов
Комары. При испытании АЮГ в отношении личинок комаров их следует вносить в сосуды с водой, где содержатся личинки комаров IV возраста. Наблюдения за развитием личинок проводят ежедневно, регистрируя особи с признаками начала окукливания, затем - формирующие куколку. Показателями эффективности являются: 1) отсутствие нормально сформированной куколки, 2) особи, которые не смогли освободиться от экзувия, 3) особи, которые не смогли подняться с поверхности воды.
ИСХ вносят в воду с личинками комаров I - II возраста и ежедневно наблюдают за процессом линьки, отмечая ее нарушения. Появление куколок свидетельствует о прекращении действия препарата.
Мухи. АЮГ вносят в субстрат, где происходит развитие преимагинальных стадий, в период, когда преобладают личинки III возраста. Показатель эффективности - отсутствие вылета нормально сформированных имаго.
ИСХ вносят в субстрат для развития преимагинальных стадий при наличии любых личиночных возрастов. Показатель эффективности - отсутствие нормально сформированной куколки.
Блохи. Испытания проводят методом обработки субстрата (песок + альбумин), где развиваются личинки блох. Соединения можно вносить в виде растворов в ацетоне, который быстро испаряется, а вещество остается в субстрате. Показатели эффективности: 1) нарушения в развитии личинок, 2) отсутствие нормально сформированного кокона, 3) отсутствие выплода жизнеспособных имаго.
Тараканы. Испытания АЮГ и ИСХ проводят на имаго и личинках методом скармливания отравленных пищевых приманок в течение 1 - 3 суток, особи с явными нарушениями в развитии появляются не ранее чем через 5 - 7 дней. Учет эффективности АЮГ и ИСХ аналогичен: 1) количество особей с нарушениями, 2) отсутствие жизнеспособных оотек, 3) выплод нормального поколения.
3.4. Методы изучения репеллентной активности веществ
Отбор веществ, обладающих репеллентной активностью, проводят в два этапа: на первом этапе определяют уровень репеллентной активности в сравнении с эталоном, которым является диэтилтолуамид (ДЭТА) в аналогичных концентрациях, на втором этапе изучают спектр репеллентного действия веществ в разных концентрациях по отношению к различным видам насекомых.
3.4.1. Определение репеллентной активности веществ по отношению к лабораторной культуре комаров методом ольфактометрии
На полоски фильтровальной бумаги или ткани (бязь) размером 2 x 6 см наносят 0,12 мл 5 - 20%-ных растворов испытуемых соединений, 0,5%-ных растворов синтетических и натуральных душистых веществ. Тесты помещают в ольфактометр после полного высыхания тестов.
Для опытов используют ольфактометр, основная часть которого состоит из цилиндрической камеры высотой 12 см и диаметром 30 см. Камера имеет по окружности 24 отверстия, в которые впаяны трубки диаметром 2,5 см, длиной 6 - 8 см. Трубки имеют боковые отводки, а на конце Т-образные приемники, в которые через трубки вылетают насекомые. Один конец приемников закрывают мельничным газом, другой - пробкой. Внутрь боковых отводов трубок вкладывают полоски тестов, пропитанные раствором изучаемого вещества. Внутри камеры имеется подвижная цилиндрическая шторка высотой 6 см, плотно прилегающая к стенкам ольфактометра. При движении шторки вверх-вниз одновременно закрываются или открываются боковые отверстия приемников с изучаемыми веществами, позволяя или препятствуя комарам, находящимся в камере, залететь в трубки и реагировать на пары репеллентов. В приборе использована реакция бегства насекомых при возбуждении и стремление их лететь к свету через трубки.
Ольфактометр помещают в специально оборудованный бокс, где поддерживают оптимальные для насекомых условия: температуру воздуха 26 +/- 1 °C, относительную влажность 60 - 70%, и имеется постоянный источник света (лампа 150 Вт). В камеру ольфактометра помещают 500 голодных комаров, открывают, опуская шторку, боковые отверстия, включают электромотор и лампу, расположенную над камерой. Камера медленно вращается вокруг оси для выравнивания освещения. Экспозиция - 15 мин. За это время основная часть насекомых покидает камеру и распределяется по трубкам. Для подсчета насекомых, находящихся в трубках, шторку закрывают, а насекомых усыпляют эфиром. Степень отпугивающего действия вещества определяют по числу комаров, залетевших в трубки с обработанными и контрольными полосками, и вычисляют КОД (формула 9).
При определении длительности отпугивающего действия обработанные полоски испытывают каждые 3 - 5 суток вплоть до утраты ими репеллентных свойств, когда КОД становится ниже 70%. При изучении быстро испаряющихся веществ (натуральные душистые вещества и др.) опыты следует проводить чаще (в отдельных случаях - ежедневно).
3.4.2. Определение репеллентной активности веществ по отношению к лабораторной культуре блох методом ольфактометрии
Метод основан на способности голодных блох вспрыгивать и оставаться длительное время на колеблющихся полосках бумаги или ткани.
Полоски бумаги или ткани размером 1,5 x 14,5 см пропитывают 0,2 мл раствора испытуемого вещества (препарата) в 3 повторностях. Соединения изучают в 2 - 5 - 10 - 20% концентрации, синтетические и натуральные душистые вещества - в 1%-ной концентрации. Контрольные полоски пропитывают 0,2 мл растворителя.
Опыты проводят в ольфактометре, который представляет собой цилиндрическую камеру с внутренним цилиндром. На оси под верхней крышкой расположен вращающийся диск. На диске по окружности имеются 24 отверстия, куда вставляют стеклянные трубки с развернутым верхним краем и внутренним диаметром не менее 15 мм. Высота внешнего цилиндра - 15 см, диаметр - 25 см, внутреннего - 15 и 17 см соответственно. Трубки висят между стенками наружного и внутреннего цилиндров.
При проведении опыта обработанные и контрольные полоски помещают в трубки ольфактометра, чередуя 1 контрольный с 4 - 5 обработанными, и закрывают сверху пробками. На дно камеры между внешним и внутренним цилиндрами помещают 500 голодных блох. Экспозиция - 20 мин. Для равномерного распределения насекомых диск с трубками вращают с помощью мотора со скоростью 10 оборотов в минуту. Насекомые покидают камеру прибора и распределяются по полоскам в трубках. По окончании экспозиции мотор выключают, трубки быстро извлекают из прибора, помещают в пробирки, расположенные в штативе, блох усыпляют и подсчитывают.
Степень отпугивающего действия веществ определяют по соотношению числа блох, оставшихся на обработанных и контрольных полосках. Коэффициент отпугивающего действия (КОД) вычисляют по формуле (9).
Длительность репеллентного действия устанавливают на полосках, которые повторно проверяют один раз в 2 - 3 суток, а в промежутках между опытами хранят подвешенными при комнатной температуре.
3.4.3. Определение репеллентной активности веществ по отношению к иксодовым клещам
3.4.3.1. Метод отсекающей концентрации
Для иксодовых клещей, обладающих свойством отрицательного геотаксиса, возможны два варианта опытов: по отсекающей концентрации и по градиенту концентраций. В первом, более простом варианте, используют тест из полоски хлопчатобумажной бязи размером 10 x 70 см. На нее карандашом наносят отметки длины от 0 до 60 см, причем первая (нулевая) отметка делается на расстоянии 10 см от края. На участок ленты, размещенной горизонтально на невпитывающей поверхности

ОРГАНИЗАЦИЯ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА ЗА КЛЕЩЕВЫМ РИККЕТСИОЗОМ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУ 3.1.1755-03 (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 28.09.2003)  »
Постановления и Указы »
Читайте также