МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ, ПОЛУЧЕННОЙ ИЗ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 2.3.2.970-00 (утв. Минздравом РФ 24.04.2000)


Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
24 апреля 2000 года
Дата введения -
1 июля 2000 года
2.3.2. ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ
МЕДИКО - БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ,
ПОЛУЧЕННОЙ ИЗ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ
ИСТОЧНИКОВ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 2.3.2.970-00
1. Разработаны Институтом питания РАМН (Тутельян В.А. - руководитель, Аксюк И.Н., Васильев А.В., Воробьева Л.Ш., Высоцкий В.Г., Волгарев М.Н., Королев А.А., Кравченко Л.В., Маганова Н.Б., Мазо В.К., Покровская Г.Р., Сокольников А.А., Сорокина Е.Ю., Тышко Н.В.); Институтом вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН (Семенов Б.Ф., Брицина М.В., Захарова Н.С.); Министерством здравоохранения РФ (Департамент госсанэпиднадзора) (Онищенко Г.Г., Петухов А.И.); Московской медицинской академией им. И.М. Сеченова Минздрава России (Бочков Н.П., Суханов Б.П.); Центром "Биоинженерия" РАН (Скрябин К.Г., Кузнецов Б.Б., Дорохов Д.Б., Асадова Ю.Е.); Медико - генетическим центром РАМН (Шишкин С.С.); Московским государственным университетом прикладной биотехнологии Министерства общего и профессионального образования Российской Федерации (Рогов И.А., Кроха Н.Г., Гурова Н.В., Сучков В.В.).
2. Утверждены 20 апреля 2000 г., введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 1 июля 2000 г.
3. Введены впервые.
1. Общие положения и область применения
1.1. Методические указания устанавливают требования к проведению медико - биологических исследований пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников.
1.2. Методические указания предназначены для учреждений санитарно - эпидемиологической службы Российской Федерации, осуществляющих государственный санитарно - эпидемиологический надзор, а также для других учреждений, аккредитованных на проведение работ в этой области.
1.3. Требования, изложенные в настоящих Методических указаниях в отношении продукции, полученной из генетически модифицированных источников, применяются на этапах постановки на производство, гигиенической экспертизы, государственной регистрации, закупки, ввоза в страну и реализации.
1.4. Методические указания разработаны с целью обеспечения единого, научно - обоснованного подхода к оценке качества и безопасности пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников, на этапах разработки, экспертизы и государственной регистрации этой продукции.
1.5. Производитель новой пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников, предназначенной для реализации на территории Российской Федерации, должен выпускать ее маркированной в соответствии с установленным порядком.
2. Нормативные ссылки
2.1. Федеральный закон "О санитарно - эпидемиологическом благополучии населения" от 30 марта 1999 г.
2.2. "Основы законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан" от 22 июля 1993 г.
2.3. Федеральный закон "О внесении изменений и дополнений в Закон Российской Федерации "О защите прав потребителей" и Кодекс РСФСР об административных правонарушениях" от 9 января 1996 г.
2.4. Положение о государственном санитарно - эпидемиологическом нормировании, утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации от 5 июня 1994 г. N 625.
2.5. Положение о Государственной санитарно - эпидемиологической службе Российской Федерации, утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации от 30 июля 1998 г. N 680.
В официальном тексте документа, видимо, допущена опечатка: Постановление Правительства РФ издано 30.06.1998, а не 30.07.1998. 2.6. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации N 7 от 6 апреля 1999 г. "О порядке гигиенической оценки и регистрации пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников".
3. Термины и определения
Пищевая продукция - продовольственное сырье, пищевые продукты и их компоненты.
Продовольственное сырье - объекты биологического, органического и неорганического происхождения, используемые для производства пищевых продуктов.
Пищевой продукт - продукт животного, растительного, минерального или биосинтетического происхождения, предназначенный для употребления в пищу человеком, как в натуральном, так и в переработанном виде.
Компонент - вещество животного, растительного, микробного или минерального происхождения, а также природные или синтезированные пищевые добавки, используемые при подготовке или производстве пищевого продукта или присутствующие в готовом продукте в исходном или измененном виде.
Качество пищевой продукции - совокупность характеристик, которые обуславливают потребительские свойства, качество и безопасность пищевой продукции.
Безопасность пищевой продукции - отсутствие опасности для жизни и здоровья людей нынешнего и будущих поколений.
Генная инженерия - раздел молекулярной генетики, связанный с целенаправленным созданием in vitro новых комбинаций генетического материала (рекомбинантной ДНК), способного к воспроизводству и функционированию в клетке - хозяине.
Генетически модифицированный организм - организм или несколько организмов, любые неклеточные, одноклеточные или многоклеточные образования, способные к воспроизводству или передаче наследственного генетического материала, отличные от природных организмов, полученные с применением методов генной инженерии и содержащие генно - инженерный материал, в т.ч. гены, их фрагменты, или комбинацию генов.
4. Порядок гигиенической экспертизы
и государственной регистрации пищевой продукции,
полученной из генетически модифицированных
источников
4.1. Вся пищевая продукция, полученная из генетически модифицированных источников, проходит гигиеническую экспертизу в установленном порядке.
4.2. Проведение гигиенической экспертизы и государственной регистрации пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников, осуществляется в соответствии с порядком, установленным Постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации N 7 от 06.04.99 "О порядке гигиенической оценки и регистрации пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников".
4.3. Организация, фирма представляют в центр санитарно - эпидемиологического нормирования, гигиенической сертификации и экспертизы Министерства здравоохранения Российской Федерации комплект документов и материалов, включающий:
- заявку (письмо) на проведение гигиенической оценки и государственной регистрации пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников;
- материалы, отражающие медико - генетическую оценку пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников;
- материалы, отражающие технологические свойства пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников;
- материалы, отражающие медико - биологическую оценку пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников.
4.4. Объем и программа проведения работ по оценке качества и безопасности пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников, определяется по результатам экспертизы представленных материалов.
4.5. Для проведения работ по оценке качества и безопасности пищевых продуктов, полученных из генетически модифицированных источников, фирма - изготовитель поставляет образцы продукции, в количестве, необходимом для проведения полного объема исследований.
4.6. На основании экспертизы представленных документов и материалов и результатов проведенных медико - генетических, технологических и медико - биологических исследований продукции центр санитарно - эпидемиологического нормирования, гигиенической сертификации и экспертизы Минздрава России оформляет бланк регистрационного удостоверения (или мотивированное заключение об отказе) и передает его на подпись в Департамент госсанэпиднадзора Минздрава России. Регистрационное удостоверение подписывается Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, а в его отсутствие - начальником Департамента госсанэпиднадзора, заместителем Главного государственного санитарного врача Российской Федерации.
5. Медико - генетическая оценка пищевой продукции,
полученной из генетически модифицированных
источников
Необходимость проведения тех или иных исследований по данному разделу и для каждого конкретного вида пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников, определяется экспертом центра "Биоинженерия" РАН. Методы, описанные в пунктах 5.1 - 5.3, являются обязательными при проведении медико - генетической оценки пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников; методы, представленные в пункте 5.4, могут рекомендоваться как дополнительные.
5.1. Rapd анализ генотипов
Необходимое оборудование и реактивы
Оборудование и принадлежности
Микроцентрифужные пробирки типа Eppendorf на 1,5 и 0,5 мл (свободные от ДНК-аз и РНК-аз фирма Alpha)
Тефлоновый пестик и/или стеклянная палочка под размер микроцентрифужной пробирки на 1,5 мл <*>
Настольная микроцентрифуга типа Eppendorf (ТЭТА-20, 200000 об./мин.) <*>
Автоматические микропипетки переменного объема (классик / студент 0,5 - 10 мкл; 5 - 40 мкл; 200 - 10000 мкл)
Наконечники для микропипеток (наконечники "микро" и обычные)
Холодильник (охладитель проб) <*>
Плавающий штатив - "плотик" для микроцентрифужных пробирок
Весы до 0,5 кг
Микроанклав - "скороварка"
Бидистиллятор
ДНК-амплификатор ("Ампли-4")
Электрофоретическое оборудование для разделения фрагментов ДНК в агарозном геле: источник напряжения для электрофореза (НИП 300) <*> и прибор для горизонтального мини - электрофореза (мини - камера) <*>
УФ осветитель для визуализации результатов электрофореза ДНК (трансиллюминатор - UVT) <*>
Зеркальная фотокамера типа "Зенит" с оранжевым светофильтром
Фотопленка типа "Микрат-200"
Термостат ("Темо 24-15")
Шейкер (3D)
Микровстряхиватель пробирок типа Vortex (ТЭТА-2 или 4) <*>
РН-метр
Фитотрон для выращивания растений (Фитотрон-99)
Настольный ламинарный бокс (ЛБ-1)
--------------------------------
<*> Обозначение продукции, которая изготавливается на ООО "Biokom", Москва, Россия.
Необходимые реактивы и растворы
Реактивы
Трис (hydroxymethyl) aminometane
HCl конц.
ЭДТА
NaCl
SDS
Ацетат калия
Этиловый спирт 96%
Агароза для электрофореза
Бромистый этидий
Борная кислота
Бромфеноловый синий
Глицерин
Набор для амплификации ДНК
(Biomaster - S.r.l. - Italy - Russia, Москва)
Приготовление основных растворов
1 М Трис pH-7,5. Растворить 121,1 г Трис в 800 мл воды. Довести pH до необходимого значения добавлением концентрированной HCl и довести объем до 1 л. Раствор простерилизовать.
0,5 М ЭДТА pH-8,0. К 186,1 г ЭДТА добавить 800 мл воды. Довести pH до 8,0 NaOH.
5 М NaCl (х.ч. или ч.д.а.). 29,22 г NaCl растворить в 80 мл воды и довести объем до 100 мл, простерилизовать.
10-процентный SDS. 10 г SDS растворить в 90 мл воды, чтобы ускорить растворение, можно нагреть раствор до 60 град. C. Довести pH до 7,2 добавлением нескольких капель концентрированной HCl и довести до 100 мл. Внимание! При взвешивании SDS наденьте на лицо маску, т.к. при попадании на слизистую оболочку носоглотки этот летучий порошок вызывает сильное раздражение.
Экстракционный буфер (200 мМ Трис-HCl pH-7,5, 250 мМ NaCl, 25 мМ ЭДТА, 0,5-процентный SDS). Для приготовления 100 мл экстракционного буфера необходимо: 20 мл 1 М Трис-HCl (pH-7,5), 5 мл М NaCl, 5 мл 0,5 М ЭДТА, 5 мл 10-процентного SDS. Довести водой объем раствора до 100 мл.
5 М Ацетат калия. 49,1 г ацетата калия растворить в 80 мл воды и довести объем до 100 мл.
70-процентный этанол. Для приготовления 100 мл раствора требуется 73 мл 96% этанола и 27 мл воды.
ТВЕ 5Х буфер (0,089 М Трис - основание, 0,089 М борная кислота, 0,002 М ЭДТА pH-8,0). На 1 л раствора требуется: 54 г Трис, 27,5 г борной кислоты (ч.д.а.), 4,6 г Na2EDTAx2H20. Для приготовления электродного буфера ТВЕ-0,5X необходимо стоковый буфер разбавить в 10 раз дистиллированной водой.
Буфер для нанесения образца-6X (0,25-процентный бромфеноловый синий, 30-процентный глицерин, 10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА). Для приготовления 10 г буфера для нанесения требуется: 2,5 мг бромфенолового синего, 3 г глицерина, 0,1 мл Трис, 0,02 мл 0,5 М ЭДТА pH-8,0.
Раствор бромистого этидия (10 мг/мл). Растворить 1 г бромистого этидия в 100 мл воды. Для визуализации ДНК в агарозном геле используется раствор в концентрации 5 мкг/мл. Внимание! Все манипуляции с бромистым этидием и его растворами проводить в перчатках.
Выделение ДНК из растительной ткани
Для получения растительной ткани семена, клубни или другой растительный материал проращивают в контролируемых условиях до получения листьев или свежей растительной ткани.
Высечку листа, полученную при закрытии крышки пробирки типа Eppendorf объемом 1,5 мл или 10 - 14 мг ткани (когда высечку получить сложно), интенсивно гомогенизируют в 400 мл экстракционного буфера (необходимые растворы и реактивы) с помощью тефлонового пестика.
Примечание. Для выделения ДНК лучше брать молодые листья с мягкими тканями, без видимых следов поражения. Тефлоновый пестик должен плотно прилегать к стенкам пробирки. Стараться максимально минимизировать время гомогенизации. Гомогенизацию вести до интенсивного окрашивания в зеленый цвет экстракционного буфера.
Пробирки с гомогенатом встряхивать 5 сек. на Vortex.
Поместить пробирки в ультратермостат и инкубировать при 65 град. C 15 мин., периодически перемешивая содержимое пробирки мягким покачиванием.
Добавить в пробирки по 200 мкл 5 М ацетата калия (предварительно охлажденного в холодильнике) и тщательно перемешать содержимое пробирок легким встряхиванием.
Инкубировать пробы на ледяной бане 15 мин.
Центрифугировать пробы в настольной центрифуге при 16000 g 20 мин. при комнатной температуре.
Осторожно отобрать 400 мкл супернатанта в чистые пробирки и осадить двумя объемами 96-процентного этанола (охлажденного), осторожно перемешивая. На этом этапе можно наблюдать образование маленькой "медузы" или мелко дисперсной взвеси. Оставить пробирки на столе на 5 мин.
Центрифугировать пробы в настольной центрифуге при 16000 g 10 мин. при комнатной температуре.
Осадок ДНК промыть охлажденным при -20 град. C 70-процентным этанолом и центрифугировать, как это указано в предыдущем пункте. Рекомендуем повторить эту процедуру еще раз.
Слить надосадочную жидкость и с помощью микропипетки максимально удалить остатки жидкости из пробирки.
Осадки ДНК подсушить, открыв крышки пробирок.
Примечание. Старайтесь не пересушить осадки ДНК, т.к. пересыхание ДНК приводит к плохой растворимости в воде.
Растворить ДНК в 100 мкл стерильной бидистиллированной и деионизированной воды.
Измерить концентрацию ДНК.
Амплификация геномной ДНК
Амплификацию геномной ДНК проводят в 25 мкл реакционной смеси (67 мМ Трис-HCl pH-8,8; 16 мМ (NH4)2SO4; 2 mМ MgCl2; 0,01% Tween-20; по 200 мМ каждого dNTP; 10 рМ/мл праймера; 25 мкг геномной ДНК и 0,5 ед. Taq-полимеразы). Все компоненты, кроме ДНК, входят в набор для амплификации фирмы Biomaster.
Стерильные пробирки типа Eppendorf на 0,5 мл поместить в штатив и подписать.
В одной из пробирок сформировать реакционную смесь, последовательно добавляя компоненты, как это указано в примере.
Пример составления реакционной смеси
-------------------------------T------------------T--------------¬
¦ Ингредиенты ¦На одну пробу, мкл¦На 7 проб, мкл¦
+------------------------------+------------------+--------------+
¦H2O ¦ 16,8 ¦ 117,6 ¦
+------------------------------+------------------+--------------+
¦Реакционный буфер без ¦ ¦ ¦
¦MgCl2(10X) ¦ 2,5 ¦ 17,5 ¦
+------------------------------+------------------+--------------+
¦MgCl2 ¦ 1 ¦ 7 ¦
+------------------------------+------------------+--------------+
¦Смесь dNTP"s ¦ 2 ¦ 14 ¦
+------------------------------+------------------+--------------+
¦Праймер (4 ОЕ/мл) ¦ 0,5 ¦ 3,5 ¦
+------------------------------+------------------+--------------+
¦Термостабильная ДНК полимераза¦ 0,2 ¦ 1,4 ¦
¦(4 Е/мл) ¦ ¦ ¦
+------------------------------+------------------+--------------+
¦ДНК ¦ 2 ¦ - ¦
L------------------------------+------------------+---------------
Развести реакционную смесь по соответствующим пробиркам.
Внести в пробирки геномную ДНК и тщательно пипетировать для перемешивания пробы.
Поверх реакционной смеси наслоить несколько капель минерального масла (около 17 мкл).
Для удаления пузырьков воздуха пробирки центрифугировать в течение нескольких секунд в настольной центрифуге и перенести пробы в штатив амплификатора ДНК.
Установить и запустить следующую программу амплификации ДНК:
1 цикл: 94 град. C - 3 мин.; 36 град. C - 1,5 мин.; 72 град. C - 1,5 мин.; II.33 цикла: 94 град. C - 0,3 мин.; 36 град. C - 1,5 мин.; 72 град. C - 1,5 мин.; III - 1 цикл: 94 град. C - 0,3 мин.; 36 град. C - 1,5 мин.; 72 град. C - 10 мин.
Примечание. Ввиду большой чувствительности RAPD-анализа рекомендуем пользоваться только одним амплификатором и только одним выбранным набором реактивов для амплификации ДНК. Все реактивы для амплификации и препараты ДНК необходимо хранить в морозильной камере при 20 град. C. Перемораживание (ниже -20 град. C) препарата термостабильной ДНК-полимеразы приводит к потере ее активности.
Электрофорез в агарозном геле и визуализация продуктов амплификации
Для приготовления 2-процентной агарозы необходимо к 1 г агарозы добавить 0,5X ТВЕ буфер до 50 мл и тщательно перемешать. Колбу закрыть фольгой.
Колбу с агарозой поместить в мини-автоклав или скороварку и автоклавировать 15 мин.
Расплавленную агарозу охладить до 50 град. C и залить в подготовленную форму для геля, избегая образования пузырьков в геле. Толщина геля должна быть 0,5 - 0,7 см.
Через 30 - 40 мин., когда гель сформируется, удалить гребенку и перенести его в камеру для электрофореза, предварительно заполненную буфером ТВЕ 0,5X. Гель должен быть полностью покрыт буфером на 1 - 2 мм.
К 2 мкл буфера для нанесения добавить 10 - 13 мкл реакционной смеси, содержащей продукты амплификации ДНК, тщательно перемешать пипетированием и нанести в лунки агарозного геля. В крайнюю лунку нанести маркер молекулярной массы.
Примечание. Обычно в качестве маркера молекулярной массы используют ДНК фага ламбда, обработанную рестриктазой Hind III и EcoR I или Pst I.
Электрофорез проводят при 50 В (5 В/см) пока бромфеноловый синий не дойдет до отметки 1 см от края геля. Обычно электрофорез длится 3 - 3,5 часа.
Для визуализации фрагментов амплифицированной ДНК гель помещают в раствор бромистого этидия (5 мкг/мл) и проводят окрашивание в течение 20 мин. на качалке.
Примечание. С раствором бромистого этидия и окрашенным гелем необходимо работать в перчатках.
Чтобы снизить фоновую флюоресценцию, вызываемую бромистым этидием, гель отмывают дважды дистиллированной водой при постоянном покачивании.
Примечание. Длительная отмывка геля может привести к исчезновению слабых зон и размыванию спектров из-за диффузии.
Гель поместить на фильтр трансиллюминатора и просмотреть в проходящем УФ свете через защитный экран и специальные защитные очки. При необходимости RAPD спектры фотографируют через оранжевый или красный светофильтр на пленку типа "Микрат". Фрагменты амплифицированной ДНК после обработки этидиум бромидом будут флюоресцировать под УФ оранжевым цветом.
Примеры использования RAPD анализа для идентификации
генотипов картофеля
В работе использованы 19 декамерных праймеров. Спектры амплифицированной ДНК картофеля имели большое количество фрагментов различной длины. Анализ RAPD спектров сортов картофеля с использованием праймера PtA-19 выявил значительный полиморфизм между видами (рис. 1) <*>. Полученные данные свидетельствуют о существенной внутрисортовой вариабельности некоторых старинных отечественных сортов. С использованием ограниченного числа праймеров на различных сортах получены RAPD спектры, специфичные для отдельного сорта. Анализ спектров ДНК позволяет выявить незначительные различия между близкородственными сортами, даже те что были получены как сомаклональные варианты одних и тех же родителей.
Основанная на ДНК анализе идентификация может использоваться в тех случаях, когда сорта не могут быть надежно различены по результатам белкового электрофореза, включая анализ во всех стадиях развития растения.
Разработанный быстрый метод для изоляции ДНК из глазков картофеля и RAPD методика помогают сократить время и стоимость анализа. Идентификация сортов по анализу ДНК может быть сделана менее чем за 24 ч.
Контроль соматических модификаций в геноме размножаемого in vitro и трансформированного картофеля по тем же праймерам доказал высокую эффективность анализа ДНК при идентификации генотипов растений (рис. 2) <*>.
--------------------------------
<*> Рисунки не приводятся.
Заключение. Предлагаемый микрометод выделения геномной ДНК из растительного материала для RAPD-анализа является быстрым, экономичным, так как не требует дорогостоящего оборудования и реактивов по сравнению с другими молекулярными методами оценки растительных генотипов, а также простым в исполнении. Растительный материал может быть взят как из поля, теплицы, так и выращен в лабораторных условиях. Данный микрометод не требует больших количеств растительной ткани (1 - 20 мг), что является большим преимуществом в сравнении с другими методами, так как позволяет сохранить растение для дальнейшей работы. Перечисленные достоинства этого метода делают его очень удобным при работе с большим количеством проб при массовом анализе, а также при изучении отдельных генотипов растений.
5.2. Определение наличия трансгенной ДНК
в готовых продуктах питания
Стандартно принятыми методами для определения наличия чужеродного генетического материала и его продуктов являются иммунологический анализ и выявление трансгенной ДНК при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР). В случае исследования пищевых продуктов, при изготовлении которых исходное сельскохозяйственное сырье подвергается температурной обработке, иммунологический анализ может давать нестабильные и плохо воспроизводимые результаты, поскольку денатурированные белки часто не способны вступать в специфические реакции с антителами к нативному белку.
Полимеразно - цепная реакция в этом смысле обладает тем преимуществом, что температурная обработка сырья не влияет на качество ДНК как матрицы и поэтому содержащаяся в продуктах питания и полуфабрикатах остаточная ДНК исходного сырья при проведении ПЦР дает такие же результаты, как и нативная ДНК. Вторым критерием в пользу выбора ПЦР как метода анализа является высокая чувствительность метода, превосходящая как минимум на два порядка чувствительность известных иммунологических методов. Помимо этого, ПЦР является гораздо менее дорогим и более стабильным методом, чем другие методы анализа. Еще одним немаловажным достоинством ПЦР является то, что используемые в реакции синтетические олигонуклеотиды при правильном их выборе могут быть применены для проведения анализов различных трансгенов, что в случае иммунологических методов невозможно.
Методы определения наличия трансгенной ДНК
в готовых продуктах питания при помощи полимеразной
цепной реакции
Выделение ДНК из тестируемого продукта
В выборе метода выделения ДНК определяющую роль играет содержание масла в продуктах питания. При повышенном содержании масла (шоколад, нерафинированное растительное масло и пр.) проводится дополнительная экстракция суспензией неполярных растворителей с водой. Это позволяет перевести содержащуюся в пищевом продукте ДНК в водную фазу, в которой и производится дальнейшая очистка. Для окончательной очистки используется оригинальная методика, разработанная в центре "Биоинженерия".
Обычная длина ПЦР фрагмента при выявлении трансгенной ДНК не превышает 1000 пар оснований, поэтому в основу нижеследующих методик легли процедуры выделения и очистки, позволяющие получить достаточно чистые препараты ДНК для проведения ПЦР. Вторым критерием отбора методик явилось требование минимизации времени, затрачиваемого на выделение одного препарата ДНК.
Методика
1. 0,5 г образца пищевого продукта гомогенизируют при помощи стеклянного или тефлонового пестика в 0,5 мл буфера А (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mМ EDTA, 500 mМ NaCl, 10 mМ бета - меркаптоэтанола).
2. После гомогенизации добавляют 100 мкл 20% SDS. Смесь тщательно перемешивают и инкубируют 20 - 30 мин. при 65 град. C.
3. Охлаждают до 4 град. C, добавляют 0,3 мл 5 М ацетата калия, перемешивают в вортексе и центрифугируют 10 мин. при 15000 об./мин. на микрофуге при комнатной температуре.
4. К надосадку добавляют 1 мл смолы Wizard MaxiPreps (Promega, США) и инкубируют смесь 10 мин. при 25 град. C.
5. Затем прокачивают полученную смесь сквозь мини-колонку Wizard (Promega, США), промывают 2 мл 80-процентного изопропанола, отжимают оставшийся в мини - колонке изопропанол центрифугированием на микрофуге (15000 об./мин., 2 мин.).
6. Добавляют в микроколонку 50 мкл дистиллированной воды, подогретой до 65 град. C.
7. Инкубируют мини - колонку с водой 10 мин. при 65 град. C, и отжимают раствор ДНК в чистую стерильную микроцентрифужную пробирку центрифугированием на микрофуге (15000 об./мин., 2 мин.).
В зависимости от содержания ДНК в конкретном пищевом продукте на проведение единичной полимеразно - цепной реакции в объеме 50 мкл требуется от 2 до 20 мкл полученного препарата ДНК.
Образцы пищевых продуктов с повышенным содержанием масла перед выделением ДНК требуется подвергнуть дополнительной экстракции эмульсией хлороформа в воде.
Для этого 0,5 г исследуемого продукта гомогенизируют в смеси 0,5 мл буфера А и 0,5 мл хлороформа и инкубируют гомогенат 20 мин. при 56 град. C. Затем охлаждают его до 4 град. C и центрифугируют 10 мин. при 15000 об./мин. на микрофуге при комнатной температуре. Водную фазу собирают и переносят в чистую пробирку. Далее продолжают, начиная с пункта 2 вышеизложенной методики.
Выбор праймеров для проведения ПЦР
Для точного определения наличия трансгенной ДНК фирмой - поставщиком должна быть представлена информация о молекулярной структуре трансгенной вставки, а именно ее нуклеотидная последовательность. Это требование вводится для того, чтобы можно было точно идентифицировать наличие конкретной генетической конструкции. В таком случае синтетические олигонуклеотиды для проведения ПЦР будут синтезированы таким образом, чтобы выявить факт наличия кодирующей области трансгена. Длина используемых при анализе специфических праймеров должна составлять не менее 25 пар нуклеотидов с целью избежания появления в результате ПЦР неспецифических продуктов реакции.
В случае, когда подобная информация по каким-то причинам не может быть представлена (к примеру, фирма - производитель продуктов питания является только переработчиком производимого другой организацией трансгенного сырья), необходимо проводить проверку на присутствие в выделяемой из тестируемой продукции ДНК набора стандартных кассет экспрессии, применяемых в мировой практике для получения трансгенных растений. К таковым относятся праймеры для выявления генов маркеров селективной устойчивости (гены устойчивости к неомицину npt II и к гигромицину hph), а также стандартно применяемых промотерных областей (промотер вируса цветной капусты E35S и прочие).
Выбор условий проведения ПЦР
Для анализа при помощи стандартных праймеров используют общепринятые в мировой практике условия проведения ПЦР.
Для случаев специфических праймеров подбор условий проведения ПЦР осуществляется для каждого конкретного случая отдельно.
Аппаратура, применяемая при проведении ПЦР и анализе ее результатов
Анализ наличия трансгенной вставки в ДНК, содержащейся в продуктах питания, осуществляется на ДНК амплификаторах "АМПЛИ-4" производства фирмы "Биоком", Москва. Термостатирование образцов осуществляется на сухих термостатах "Термо 24-15" производства фирмы "Биоком", Москва. Для проведения ПЦР используется термополимераза Taq производства фирмы "Биоком", Москва. Анализ продуктов ПЦР производится при помощи рестрикционного анализа этих продуктов путем электрофореза в агарозном геле и последующего фотографирования полученной картины на трансиллюминаторе UVTI производства фирмы "Биоком", Москва, на фотопленку "Микрат - Изопан" при помощи фотоаппарата "Зенит" или в цифровом виде при помощи цифрового фотоаппарата "Кодак-ДС 120".
Фотоотпечатки или оттиски, выполненные на лазерном принтере с разрешением не менее 600 точек на дюйм, должны быть приложены к протоколу проведения испытаний.
5.3. ПЦР-идентификация близкородственных
штаммов бактерий
В настоящее время методы молекулярной биологии, основанные на применении полимеразной цепной реакции (ПЦР) находят все более широкое применение в целях диагностики и экспресс - анализа разнообразного биологического материала. Интенсивное развитие подобных методик обусловлено очень высокой чувствительностью ПЦР, возможностью быстрого получения результатов (в течение одного рабочего дня), низкой стоимостью получаемых результатов (по сравнению с другими методиками) и технологичностью (возможностью организации действующей рабочей группы практически в любых условиях, вплоть до передвижной экспресс - лаборатории).
Другие молекулярно - биологические методы либо требуют для своей реализации организации специально оборудованных дорогостоящих лабораторий, либо дают результаты с низкой достоверностью. Типичный пример невозможности достоверной идентификации - филогенетический анализ близкородственных видов по нуклеотидной последовательности гена 16SpPHK. Такой анализ является общепринятым для полного описания новооткрытых видов бактерий, но дает результаты низкой надежности при попытке различить близкородственные виды, как это имеет место в случае идентификации промышленных штаммов Streptomyces или бацилл из группы B.anthracis.
Метод идентификации бактерий при помощи ПЦР
Выбор метода
Среди основанных на применении ПЦР молекулярно - биологических методов исследования биоразнообразия наиболее подходящим для целей идентификации бактерий является метод так называемого DAF-PCR, разработанный Caetano - Annoles (Caetano - Annoles G, Bassam В J, Gresshoff PM (1991) DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primers. Bio / Technology 9: 553 - 556). Что касается других методов, то они либо требуют слишком обширной информации о строении генома конкретного микроорганизма (прямое выявление штамм - специфичных генов), либо дают неполную для идентификации близкородственных видов информацию (RAPD-PCR, DALP-PCR), либо слишком сложны и дорогостоящи и не могут быть рекомендованы для широкомасштабного применения (AFLP-PCR). Единственным узким местом в DAF-PCR является выбор приемлемых для точной идентификации коротких олигонуклеотидных праймеров.
Выбор праймеров
Разработанное в Центре "Биоинженерия" РАН программное обеспечение для анализа нуклеотидной последовательности полных геномных бактерий позволяет провести выбор олигонуклеотидных праймеров для DAF-PCR, обеспечивающих уверенную идентификацию бактерий на уровне штамма, что соответствует индивидуальным различиям для человека и других высших эукариотов. Подобная работа проведена для идентификации близкородственных бактерий из группы В. anthracis, для которых идентификация при помощи стандартных методов (филогенетический анализ нуклеотидной последовательности гена 16SpPHK) оказалась безуспешной.
Выбор условий проведения ПЦР
Условия проведения реакции определяют степень точности и воспроизводимости результатов и должны проводиться для конкретной группы бактерий.
Создание электронной базы данных
Для полной и надежной идентификации конкретного микроорганизма необходимо создать электронную базу данных о конкретной группе бактерий, в которую включаются сведения о максимально возможном числе различных имеющихся в виде чистых культур или коллекции типовых штаммов бактерий.
Выделение ДНК
Наиболее надежные результаты в ПЦР дает ДНК, выделенная непосредственно перед постановкой реакции из замороженной бактериальной пасты с применением смолы фирмы Promega (США) по модифицированному нами методу Бирнобойма и Доли:
- 20 - 40 мкл оттаявшей бактериальной массы суспендируют в 100 мкл буфера I (50 mM Tris HCl, pH 8,0, 5 mМ EDTA, 50 mkg/ml RNAse). К суспензии добавляют 120 мкл лизирующего буфера (0,2 М NaOH, 1% SDS) и ожидают лизиса бактерий, видимого по возрастанию вязкости суспензии. После этого комплекс бактериальных белков и обломков клеточной стенки осаждают добавлением 100 мкл 2,55 М ацетата калия при энергичном встряхивании на вортексе в течение 5 мин. Жесткое встряхивание на вортексе необходимо для того, чтобы порвать длинную бактериальную ДНК, которая, будучи прикреплена в нескольких точках к мембране, в противном случае выпадает в осадок вместе с комплексом SDS-белок. Затем смесь центрифугируют на микрофуге в течение 5 - 10 мин. Надосадок переносят в 1,5 мл пробирку для микрофуги, содержащую 0,75 мл смолы "Wizard PCR-Prep" или "Wizard Mini Prep" фирмы Promega. Смесь тщательно перемешивают и прокачивают сквозь мини-колонку, промывают осадок смолы в мини-колонке 2 мл 80% изопропанола, центрифугируют в микрофуге 1 мин. при максимальных оборотах для удаления остаточной жидкости и миниколонку помещают в стерильную 1,5 мл пробирку для микрофуги, наносят в мини - колонку 50 мкл стерильной бидистиллированной или деионизованной воды и прогревают пробирку с колонкой 5 мин. при 70 град. C. Затем мини - колонку в пробирке помещают в микрофугу и центрифугируют 1 мин. при максимальной скорости для переноса раствора ДНК в пробирку. Описанным способом получают порядка 5 мкг ДНК. Размер полученной ДНК - от 3 до 15 т.п.н., что вполне достаточно для выделения 16S РНК, бактерий (около 1500 п.н. при использовании пары праймеров 11F/1492R). При условии использования стерильных растворов и посуды получаемая ДНК может храниться при +4 град. C в течение полугода. Срок хранения препаратов ДНК при -20 град. C превышает 2 года.
Используемые реактивы и оборудование
ПЦР осуществляется на ДНК амплификаторах "АМПЛИ-4" производства фирмы "Биоком", Москва. Термостатирование образцов осуществляется на сухих термостатах "Термо 24-15" производства фирмы "Биоком", Москва. Для проведения ПЦР используется термополимераза Taq производства фирмы "Биоком", Москва. Анализ продуктов ПЦР производится при помощи рестрикционного анализа этих продуктов путем электрофореза в агарозном геле и последующего фотографирования полученной картины на трансиллюминаторе UVT1 производства фирмы "Биоком", Москва, на фотопленку "Микрат - "Изопан" при помощи фотоаппарата "Зенит" или в цифровом виде при помощи цифрового фотоаппарата "Кодак-ДС 120". Фотоотпечатки или оттиски, выполненные на лазерном принтере с разрешением не менее 600 точек на дюйм, должны быть приложены к протоколу проведения испытаний. Олигонуклеотидные праймеры синтезируются в Центре "Биоинженерия" РАН.
5.4. Методы определения общих свойств
генетической вставки
5.4.1. Выделение геномной ДНК и проведение полимеразной цепной реакции. Для выделения геномной ДНК из пробы продукта может применяться фенол - хлороформный или другой адекватный метод [124]. Полученные препараты ДНК сохраняются при минус 70 град. C и используются для анализа методом полимеразной цепной реакции (ПНР). Олигонуклеотидные праймеры для ПЦР могут быть предоставлены фирмой - изготовителем продукции или могут синтезироваться по заказу в соответствии с данными о структуре вставки.
5.4.2. При проведении ПЦР используется Taq-ДНК-полимераза производства ИБХ РАН. В типичных экспериментах полимеризационную смесь объемом 50 мкл составляют так, чтобы она содержала 350 нг геномной ДНК, 1,5 мМ каждого из четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (фирма MBI Fermentas Lithuania), 1 ед. Taq-полимеразы. Затем к полимеризационной смеси добавляют 30 пкМ пары олигонуклеотидных праймеров в буферном растворе следующего состава: 67 мМ Трис-HCl буфер (pH 8,0 при 25 град. C), содержащий 16,6 мМ сульфат аммония, 67 мМ MgCl2, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 6,7 мкМ ЭДТА и бычий сывороточный альбумин в концентрации 170 мкг/мл. Далее на каждую пробу наслаивают по 50 мкл минерального масла и реакцию проводят по программам, специально адаптированным для конкретных участков гена в многоканальном амплификаторе ДНК "Термцик" производства АО "ДНК-технология" (Москва).
При необходимости возможно проведение мультиплексной ПЦР для анализа нескольких важных фрагментов вставки.
Продукты амплификации анализируют с помощью электрофореза в пластине 6-процентного полиакриламидного геля (2,5 ч при 200 В). ДНК-маркерами служит стандартный набор фрагментов ДНК плазмиды pBR322, полученный под действием рестриктазы Alu 1 (фирма MBI Fermentas). Окрашивание фрагментов ДНК осуществляется этидиум бромидом. Анализ результатов и фотографирование электрофореграммы осуществляют в условиях ультрафиолетовой подсветки на трансиллюминаторе.
5.5. Методы оценки функционирования вставки
5.5.1. Определение мРНК, продуцируемой вставкой, которая введена в геном растения с помощью гнездовой ПЦР.
Выделение препаратов суммарной мРНК из образцов продукта гуанидин - тиоцианат - фенол - хлороформным методом [125] и проведение последующих гнездовых ПЦР с декларированными праймерами [126, 125]. Детектирование синтезированных кДНК электрофорезом в полиакриламидном геле с окрашиванием этидиум бромидом [126].
5.5.2. Двумерный электрофоретический анализ белков.
В работе используются следующие реактивы: акриламид, метиленбисакриламид, агароза, трис, глицин, додецилсульфат натрия, персульфат аммония, тритон X-100, дитиотриэтол, Амберлит МВ-1, 2-меркаптоэтанол, кумасси бриллиантовый голубой R-250, кумасси бриллиантовый голубой G-250, Tween-20, 4-хлор-l-нафтол, бычий сывороточный альбумин - фирмы "Serva" (Германия); ТВИН-20 - фирмы "Merk" (Германия) амфолины pH 3 - 10, pH 5 - 7, pH 5 - 8, фирмы "LKB" (Швеция).
В качестве расходных материалов применяются также: нитроцеллюлозные фильтры - фирмы "Schleicher and Schull" (Германия).
Белковые экстракты из всех изучающихся биологических материалов готовят сходным образом, используя для обеспечения максимальной солюбилизации белков лизирующий раствор (ЛР), с высоким содержанием денатурирующих агентов - мочевины, меркаптоэтанола (дитиотриэтола) и тритона X-100. ЛР - раствор 9 М мочевины, содержащий 5% 2-меркаптоэтанола, 2% тритон X-100, 2% амфолины 3,5 - 10.
При приготовлении ЛР сначала мочевину растворяют в деионизованной воде и дополнительно очищают добавлением Амберлит МВ-1. После 10 мин. инкубации амберлит отделяют и к раствору мочевины добавляют Тритон X-100, дитиотриэтол (или 2 - меркаптоэтанол), амфолины pH 3 - 10 до указанных концентраций.
При экстракции белков образцы тканей измельчают ножницами и несколько раз промывают холодным физиологическим раствором. Затем измельченную ткань гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в ЛР в соотношении 100 мг ткани на 2 мл ЛР и центрифугируют при 700 g в течение 10 мин. Надосадочную фракцию, содержащую солюбилизированные белки (экстракт), используют для дальнейшей работы.
Для анализа белков используют двумерный электрофорез по О"Фарреллу - метод, сочетающий фракционирование белков изоэлектрофокусированием (первое направление) с гель - электрофорезом в присутствии SDS [128, 129].
Изоэлектрофокусирование проводят в стеклянных трубках длиной 150 мм и внутренним диаметром 3,5 мм. Трубки устанавливают в штатив, герметизируют нижние отверстия пленкой Parafilm и заливают полимеризационной смесью. Для составления полимеризационной смеси готовят следующие реактивы:
1.1. 30-процентный акриламид, 1,6% метиленбисакриламид.
1.2. 20% тритон X-100.
1.3. 10-процентный персульфат аммония.
1.4. Анодный буфер для изоэлектрофокусирования: 0,01 М фосфорная кислота.
1.5. Катодный буфер для изоэлектрофокусирования: 0,02 М NaOH.
1.6. Защитный раствор: 4,5 М раствор мочевины, содержащий 1% Тритона X-100; 2,5% меркаптоэтанола, 1% амфолинов pH 3,5 - 10.
1.7. Переводный буфер для геля первого направления - белковый буфер (см. п. 2.2).
Растворы 1.1; 1.2; 1.6; 1.7 хранят при температуре +4 град. C в течение 2 - 3 недель. Остальные используют свежеприготовленными.
Приготовление 20 мл полимеризационной смеси, необходимой для заполнения 12 трубок, осуществляют, смешивая 12 г мочевины, 6,75 мл дистиллированной воды, 3 мл раствора 1.1, 2,25 мл раствора Тритона X-100 (20%). Эту смесь обрабатывают ионообменной смолой амберлит МБ-1, отфильтровывают и добавляют к ней 225 мкл амфолинов pH 3,5 - 10 и 900 мкл амфолинов pH 5 - 7. Смесь дегазируют, а непосредственно перед заливкой в трубки к ней добавляют 22,5 мкл ТЕМЕД и 32,5 мкл 10-процентного раствора ПСА.
Полимеризационную смесь в трубки вносят шприцом, заполняя трубки снизу вверх до одинакового уровня на 2 - 3 см ниже верхнего края (высота колонки геля 11 см). Сверху наслаивают воду.
После окончания полимеризации геля воду над его поверхностью удаляют и трубки устанавливают в гельэлектрофоретическую камеру "Bio-Rad", модель 175 (США). В нижний резервуар камеры наливают раствор катодный буфер. В трубки наносят анализируемые образцы в объеме 50 - 150 мкл (100 мкг белка). В полупрепаративном варианте фракционирования объем наносимого образца увеличивают до 250 - 350 мкл. Сверху, по краям трубки, наслаивают защитный раствор 1.7 и верхнюю камеру прибора заполняют анодным буфером.
Изоэлектрофокусирование до равновесного состояния проводят при напряжении, начиная с 400 В до 200 В.ч, и затем при напряжении 1000 В до суммарного значения 5400 В.ч, или (ночной режим), при напряжении 210 В двадцать часов и затем один час 1000 В до того же суммарного значения 5400 В.ч. Неравновесный вариант изоэлектрофокусирования проводят при напряжении, начиная с 400 В до 200 В.ч, и затем при напряжении 1000 В.ч до суммарного значения 1000 - 2500 В.ч.
По окончании изоэлектрофокусирования колонки геля вымачивают в 5 мл переводного буфера (раствор 1.7) 10 мин. при комнатной температуре. Затем гели, не предназначенные для немедленного фракционирования во втором направлении, быстро замораживают и хранят при температуре -20 град. C до нескольких недель.
Для фракционирования во втором направлении используют модифицированный метод Леммли [130] в пластинах с градиентом ПААГ 7,5 - 25% в присутствии SDS.
Для этой цели готовят следующие растворы, из которых затем составляют полимеризационные смеси для формирования пластин ПААГ:
2.1. 60-процентный акриламид, 0,8-процентный метиленбисакриламид.
2.2. Буфер для разделяющего геля: 1 М Трис-HCl (pH 8,8).
2.3. Буфер для концентрирующего геля: 0,5 М Трис-HCl (pH 6,8).
2.4. 10-процентный додецилсульфат натрия.
2.5. 10-процентный персульфат аммония.
2.6. Электродный буфер для электрофореза: 0,025 М Трис, 0,192 М глицин, 0,1-процентный SDS (pH 8,3).
2.7. Агарозный гель: 1% агароза в растворе 2.6 с добавлением 0,125% бромфенолового синего. После приготовления раствор необходимо прокипятить в течение 5 мин., а перед каждым использованием гель необходимо растопить.
Раствор 2.5 готовят непосредственно перед употреблением, остальные хранят при температуре +4 град. C.
Фракционирование во втором направлении осуществляют в пластинах ПААГ размером 160 x 160 x 1 мм с линейным градиентом концентрации акриламида 7,5 - 25%, в приборе для вертикального электрофореза. Пластины геля готовят в стандартных стеклянных кассетах. Пример с подробным описанием использования этого оборудования опубликован ранее [131].
Обычно для параллельного формирования 6 гелевых пластин с градиентом концентрации акриламида (разделяющий гель) готовят 2 раствора: легкий (концентрация АА 7,5%) и тяжелый (концентрация АА 25%), по 100 мл каждого. Полный состав этих растворов приведен в таблице.
Таблица
СОСТАВЫ РАЗДЕЛЯЮЩЕГО И КОНЦЕНТРИРУЮЩЕГО ГЕЛЕЙ
--------------------------------T----------------T---------------¬
¦ Компоненты ¦Разделяющий гель¦Концентрирующий¦
¦ +--------T-------+ гель ¦
¦ ¦ 25% ¦ 6,5% ¦ ¦
+-------------------------------+--------+-------+---------------+
¦АА-МБА 60 - 0,8%, мл ¦ 41,8 ¦ 12,5 ¦ 3,3 ¦
+-------------------------------+--------+-------+---------------+
¦1 M TRIS pH 8,8, мл ¦ 36 ¦ 36 ¦ - ¦
+-------------------------------+--------+-------+---------------+
¦0,5 М TRIS pH 6,8, мл ¦ - ¦ - ¦ 12,7 ¦
+-------------------------------+--------+-------+---------------+
¦10% SDS, мл ¦ 1 ¦ 1 ¦ 0,5 ¦
+-------------------------------+--------+-------+---------------+
¦H2O, мл ¦ 20,4 ¦ 49,3 ¦ 33,3 ¦
+-------------------------------+--------+-------+---------------+
¦TEMED, мкл ¦ 53 ¦ 53 ¦ 20 ¦
+-------------------------------+--------+-------+---------------+
¦10% ПСА, мкл ¦ 240 ¦ 240 ¦ 400 ¦
L-------------------------------+--------+-------+----------------
Тяжелый и легкий растворы смешивают, используя смеситель Gradient former Model 395 ("Bio-Rad", США) или аналогичное отечественное оборудование, с тем, чтобы получить линейный градиент концентрации акриламида в кассетах, которые постепенно заполняются с помощью перистальтического насоса. Обычно, одномоментно заполняется 6 пластин, что обеспечивает идентичность их изготовления и высокую воспроизводимость полученных результатов. После заполнения на полимеризационную смесь наслаивают воду. Полимеризация продолжается 30 - 40 мин. Затем воду удаляют, поверхность геля промокают фильтровальной бумагой и заливают раствор, формирующий концентрирующий гель.
Для приготовления 50 мл раствора концентрирующего геля необходимо смешать компоненты, указанные в таблице, причем катализаторы (TEMED и ПСА) добавляют непосредственно перед заливкой геля. Полимеризация заканчивается через 30 - 40 мин.
Удалив воду, на поверхность концентрирующего геля накладывают гель первого направления и заливают расплавленным агарозным гелем (раствор 2.7). С края каждой пластины формируют "карман" для нанесения белков - маркеров. В течение 5 мин. агарозный гель затвердевает, обеспечивая полный контакт геля первого направления с гелевой пластиной, и кассету помещают в прибор для электрофореза.
Электрофорез проводят при следующем режиме:
сила тока 30 мА на одну пластину
максимальное напряжение 200 В
максимальная мощность 50 Вт.
Электрофорез заканчивают, когда лидирующий краситель доходит до нижнего края разделяющего геля.
После завершения фракционирования для детекции белков на гелевых пластинах используют окрашивание кумасси R-250 и азотно - кислым серебром.
Окрашивание белков кумасси R-250 проводится по методу Fairbanks [132] в растворе: 10-процентная уксусная кислота, 25-процентный изопропанол, 0,05-процентный кумасси R-250.
Окрашивание осуществляют на водяной бане в течение 15 мин. с последующей отмывкой не связавшегося красителя 10-процентной уксусной кислотой.
Окраску азотно - кислым серебром проводят в модификации Blum [133] с использованием следующих реактивов:
раствор гипосульфита натрия (Na2S2O3 x 5H2O) - 0,2 г/л;
раствор азотно - кислого серебра на 200 мл - 0,4 г азотно - кислого серебра, 150 мкл формалина;
проявляющий раствор на 200 мл: Na2CO3 - 8 г, 4 мл раствора гипосульфита натрия, 100 мкл формалина.
Все процессы при серебрении проводятся на шейкере и в пластиковых емкостях. Гель после окрашивания кумасси R-250 отмывают от краски 10-процентной уксусной кислотой до светлого фона. Затем три раза по 20 мин. выдерживают в 25-процентном изопропаноле для удаления из геля SDS, после чего промывают дистиллированной водой (20 сек.). Далее в течение 1 мин. гель инкубируют в растворе гипосульфита и два раза по 20 сек. отмывают в дистиллированной воде. На следующей стадии гель выдерживают в растворе азотно - кислого серебра 15 мин., после чего трижды по 20 сек. промывают дистиллированной водой.
На завершающем этапе гель помещают в проявляющий раствор и окрашивание прекращают промывкой большим количеством воды, когда на геле перестают появляться новые пятна.
Фотографирование гелей проводится во влажном состоянии на пленку высокой чувствительности (например, Микрат 300). Гели для хранения высушиваются. Для этого их дегидратируют в растворе, содержащем 3% глицерина и 50% этанола в течение 30 мин., затем плотно фиксируют между двумя слоями целлофана и высушивают в натянутом виде при комнатной температуре.
5.5.3. Определение продукта экспрессии включенной вставки методом иммуноблоттинга.
Для проведения иммуноблоттинга необходимо располагать соответствующими мышиными антителами против кодируемого вставкой полипептида.
Для детектирования белкового продукта функционирования вставки рекомендуется использовать коньюгат против иммуноглобулинов мыши "Sigma" в разведении 1:1500 или коньюгат против иммуноглобулинов мыши "Amersham" в разведении 1:600.
На первом этапе анализа проводят электроперенос белков из ПААГ на нитроцеллюлозный фильтр фирмы "Schleicher and Schull" (Германия) по методу Towbin [135] с использованием буферного раствора, включающего 20 мМ Трис, 0,192 М глицин, 20-процентный метанол, 0,1% SDS (pH 8,3 - 8,4). Электроперенос проводят в специальной камере для вертикального электроблоттинга фирмы "BioRad" (США) (или на другом аналогичном оборудовании) при величине напряжения 15 - 16 В и силе тока 120 - 160 мА в течение ночи (12 - 14 ч).
После окончания электропереноса нитроцеллюлозный фильтр промывают в трех сменах 0,01М PBS (натрий - фосфатный буфер, pH 7,4) по 5 мин.
Для детекции перенесенных на мембрану белков фильтр в течение 5 - 10 мин. инкубируют в растворе красителя (0,25% понсо-с, 40% уксусной кислоты, 15% метанола). Фоновую окраску отмывают 0,01М PBS.
На заключительном этапе, перед связыванием моноклональных антител, фильтр промывают в 0,1М PBS, содержащем 30% изопропанола (для удаления SDS), 3 раза по 20 мин., затем пятикратно в 0,01М PBS и 0,01М PBS-0,05% tween-20. Возможную неспецифическую сорбцию антител подавляют инкубацией фильтра в растворе 1% БСА на 0,01М PBS в течение 1 ч при 37 град. C (или в течение ночи при +4 град. C). Фильтр промывают 0,01М PBS пятикратно, затем 0,1М PBS-0,05% твин-20 пятикратно. Наконец, проводится его инкубация в растворе соответствующих антител в 0,1М PBS (разведение подбирается в каждом случае). После инкубации с МКАТ фильтр отмывают 5 раз 0,1М PBS и 5 раз 0,1 PBS-0,05% твин-20 и инкубируют с пероксидазным коньюгатом против Ig G мыши 2 ч при 37 град. C. После пятикратных промывок 0,1М PBS и 0,1М PBS-твин-20 фильтр заливают буфером для окрашивания (12 мг 4-хлор-1-нафтола растворяют в 4 мл этанола, объем доводят до 20 мл 0,1М PBS и непосредственно перед применением добавляют 12 мкл 30-процентной перекиси водорода) и выдерживают до четкого проявления окрашенных зон.
5.5.4. Оценка биологических эффектов от продукта(ов) функционирования вставки.
5.5.4.1. Полупрепаративное выделение препаратов белков после фракционирования белковых экстрактов двумерным электрофорезом.
Для получения отдельных очищенных белковых препаратов двумерным электрофорезом фракционируют суммарные белковые экстракты в стандартных, описанных выше условиях. Затем детекцию белковых фракций проводят в нефиксирующих условиях 4 М раствором ацетата калия. Одноименные фракции вырезают из 20 - 40 гелевых пластин и собранные кусочки гелей до момента выделения хранят при -20 град. C.
Некоторые белки удается элюировать за счет диффузии. В этих случаях полученные кусочки гелей, содержащие одноименный белок, измельчают и гомогенизируют в деионизованной воде, после чего белок элюируют в течение 15 - 20 мин. из гомогената геля встряхиванием на магнитной мешалке. После центрифугирования в течение 20 мин. при 700 g супернатант собирают и процедура с осадком повторяется еще два раза. Объединенный супернатант (объем около 50 мл) лиофилизируют, осадок перерастворяют в 1 - 2 мл деионизованной воды и на холоде производят освобождение от избытка додецилсульфата натрия. Выпавший осадок отделяют центрифугированием (15 мин. при 3000 g), что обеспечивает понижение концентрации SDS в супернатанте до 0,25% [134]. Затем от остатка солей и SDS избавляются диализом против дистиллированной воды в течение 12 часов при температуре +4 град. C.
Неэлюирующиеся прямо белки получают электроэлюцией. Электроэлюцию проводят в приборе для фирмы "Bio-Rad" (США) или аналогичном оборудовании. При первом употреблении диализной мембраны (поставляемой в комплекте с прибором) ее инкубирют в течение 30 мин. в электродном буфере для электрофореза (раствор 2.6) при температуре 60 град. C. Фрагменты геля, содержащие искомую фракцию, укладывают в стеклянную трубку, соединенную с диализной мембраной и заполненную электродным буфером для электрофореза. Трубку устанавливают в прибор, в верхнюю и нижнюю камеру заливают буфер для электрофореза, подключают электроды и процесс проводят в течение ночи при постоянной силе тока из расчета 5 мА на каждую трубку и ограничении по напряжению. Белок концентрируется в объеме около 400 мкл буфера, этот раствор собирают, мембрану промывают и эту порцию раствора прибавляют к основной. В дальнейшем раствор белка подвергают диализу, измеряют концентрацию белка по методу Бредфорд и лиофилизируют.
В работе для определения концентрации белка в различных растворах используют методику Бредфорд [136]. В основе метода лежит связывание красителя кумасси бриллиантового голубого G-250 с белком в растворе.
Для анализа отбирают образцы (разбавленные в случае необходимости), содержащие 1 - 10 мкг белка в 0,1 мл. К 25 мкл образца добавляют 25 мкл раствора красителя, содержащего 0,05% кумасси бриллиантового синего G-250, 5% этанола, 10% ортофосфорной кислоты и измеряют поглощение при 594 нм. Концентрацию белка определяют по калибровочной кривой, построенной для раствора бычьего сывороточного альбумина ("Serva").
5.5.4.2. Проверка биологических свойств продукта функционирования вставки на культурах клеток человека.
Для проверки биологических свойств продукта функционирования вставки используют тест - системы на основе культур постнатальных диплоидных фибробластов человека, полученных как описано ранее [137].
Культивирование клеток проводят в питательной среде DMEM (фирмы "ПанЭко", РФ) с добавлением 5% сыворотки крупного рогатого скота и 5% сыворотки пуповинной крови человека (фирма "ПанЭко", РФ), используя или стеклянные флаконы Карреля, или пластиковые одноразовые матрасы фирмы "Costar" (Нидерланды), или в 96-луночные планшеты фирмы "Nunc" (Дания). В качестве органических красителей применяют витальный краситель метиленовый синий [138] и краситель Гимза [139] (фирма "Merck", Германия).
На первом этапе устанавливают зависимости между количеством клеток в лунке и интенсивностью окраски метиленовым синим, для чего клетки высевают с различной плотностью в 96-луночные планшеты и культивируют в течение 1 суток при 37 град. C. Далее клетки прижизненно окрашивают в течение 1 ч метиленовым синим, добавляя в каждую лунку 25 мкл раствора красителя. Затем окрашенные клетки дважды споласкивают водой и высушивают на воздухе. Измерение оптической плотности материала лунок проводят на электрофотометре "ЭФОС 9305" (фирма "ЭФОС", РФ) при 594 нм. Результаты определения оптической плотности и количества посеянных в лунку клеток обрабатывают с помощью компьютерной программы "SigmaPlot" или аналогичных компьютерных программ.
При изучении влияния продукта функционирования вставки на пролиферативную способность фибробластов человека к клеткам, растущим в 96-луночных платах, добавляют разные количества препарата этого белка и после 4 суток культивирования пробы окрашивают метиленовым синим, как описано выше. Параллельно все пробы микроскопируют (МБИ-3, ЛОМО, адаптированный как инвертированный микроскоп с помощью специальной насадки) для оценки морфологического состояния растущих клеток.
Перед окрашиванием красителем Гимза клеточную суспензию разной плотности в среде DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки в объеме 200 мкл вносят в лунки 96-луночной платы. При этом первый вертикальный ряд лунок служит контролем, его не заполняют клеточной суспензией. Платы инкубируют в атмосфере 5-процентного углекислого газа при температуре 37 град. C. Через сутки клетки фиксируют добавлением в каждую лунку 50 мкл холодного свежеприготовленного 2,5-процентного глютарового альдегида. Через 30 мин. фиксации при 4 град. C фиксатор из лунок удаляют, лунки дважды промывают холодным раствором Хенкса и заполняют 100 мкл красителя Гимза, специфически связывающегося с хроматином, разведенного 1:50 непосредственно перед использованием. Клетки инкубируют с красителем 3 ч при 37 град. C. Затем краситель удаляют, лунки дважды промывают раствором Хенкса, заполняют 100 мкл элюирующего раствора (0,1 М NaH2PO4 : C2H5OH - 1:1) и инкубируют при комнатной температуре 15 мин. при непрерывном перемешивании. Измерение оптической плотности элюирующего раствора проводят на фотометре "ЭФОС 9305" при длине волны 620 нм.
6. Оценка пищевой продукции, полученной
из генетически модифицированных источников,
по функционально - технологическим свойствам
6.1. Необходимость проведения тех или иных исследований по разделу 6 определяется экспертом Московского государственного университета прикладной биотехнологии Министерства общего и профессионального образования Российской Федерации.
6.2. В жизнедеятельности человеческого организма главенствующую роль играет белок, поэтому представляется важным проследить, не претерпевает ли он каких-либо изменений в процессе генетической модификации, поскольку генная инженерия может привести к изменению структуры и функции белков, в частности ферментов.
Свойства белка однозначно связаны с его структурой. Основным методом исследования структуры белка является метод рентгеноструктурного анализа его кристаллов. Однако для большинства белков, используемых в питании, данные об их структуре по ряду причин неизвестны. С другой стороны, известно, что структура белков также определяет их термодинамические свойства, которые, в свою очередь, влияют на их функциональные свойства.
Существует ряд методов измерения термодинамических свойств, среди которых предпочтительным методом является калориметрия. Этот метод позволяет измерять температурную зависимость теплоемкости. Из полученной зависимости можно вычислить теплоемкость для нативной и денатурированной форм белка, энтальпию и температуру денатурации белка. Вычисленные термодинамические параметры позволяют определить интегральную гидрофобность и конформационную стабильность белков [38 - 40]. Указанные характеристики тесно связаны с главными функциональными свойствами [41 - 44].
Метод ионопарной высокоэффективной жидкостной хроматографии в обращенных фазах позволяет идентифицировать единичные замены аминокислотных остатков в белковой макромолекуле и незаменим при сравнительном исследовании белков [44].
В процессе изменения генома организма в нем накапливаются компоненты, обеспечивающие его устойчивость к внешним неблагоприятным факторам - заболеваниям, насекомым - вредителям или гербицидам и т.д. В определенных концентрациях эти компоненты могут быть опасными для здоровья человека, употребляющего в пищу продукты, полученные с применением методов генной инженерии. Поэтому в процессе промышленной переработки такого сырья могут потребоваться изменения в существующих технологиях, обеспечивающие минимальное остаточное содержание опасных для здоровья компонентов. Такие изменения в технологии могут сказаться на качественных показателях (функционально - технологических свойствах) белковых препаратов, вырабатываемых из генетически модифицированного сырья. Кроме этого, предполагается целенаправленное изменение аминокислотного состава белков, выделяемых из генетически модифицированной пищевой продукции (например, имеющих сбалансированный АКС), для повышения их пищевой ценности. Это неизбежно повлечет изменение функционально - технологических свойств коммерческих белковых препаратов и отразится на качестве пищевых продуктов, в которых они используются. Это, в свою очередь, может привести к необходимости внесения изменений в технологические процессы, использующие эти препараты. Поэтому необходим непрерывный контроль (мониторинг) свойств белковых препаратов, вырабатываемых из генетически модифицированного пищевого сырья при, безусловно, безопасном содержании компонентов вредных для здоровья человека.
Микро- и макростабильность белковой молекулы определяет ряд наиболее важных функциональных свойств белка, таких, как растворимость, способность стабилизировать эмульсии и пены, образовывать гели, удерживать жир и влагу [9 - 13].
Эти функциональные свойства напрямую связаны с характеристиками готовых пищевых продуктов.
------------------------T----------------------------------------¬
¦Функциональное свойство¦ Влияние на характеристики готового ¦
¦ ¦ продукта ¦
+-----------------------+----------------------------------------+
¦pH водной суспензии ¦характеристика белковых препаратов; ¦
¦ ¦определяет принципиальную возможность ¦
¦ ¦использования белкового препарата в ¦
¦ ¦конкретном виде продукции ¦
+-----------------------+----------------------------------------+
¦Растворимость ¦используют в качестве первичного показа-¦
¦ ¦теля качества белковых препаратов; ¦
¦ ¦обусловливает реологические свойства ¦
¦ ¦белоксодержащих пищевых систем, устойчи-¦
¦ ¦вость эмульсий, стабилизированных бел- ¦
¦ ¦ком, жироудерживающую способность белко-¦
¦ ¦вых препаратов ¦
+-----------------------+----------------------------------------+
¦Реологические свойства ¦определяют уровень введения препаратов ¦
¦водных дисперсий ¦в продукт, обеспечивающий требуемый ¦
¦ ¦комплекс реологических свойств готового ¦
¦ ¦продукта, влияет на режимы материальных ¦
¦ ¦потоков в технологическом процессе ¦
+-----------------------+----------------------------------------+
¦Водоудерживающая и ¦влияют на уровень введения в продукт ¦
¦жироудерживающая ¦белковых препаратов, обеспечивающий ¦
¦способность ¦снижение потерь при технологической ¦
¦ ¦обработке (варке и жаренье), однородную ¦
¦ ¦консистенцию изделий, снижение брака в ¦
¦ ¦результате отделения воды и жира, ¦
¦ ¦сокращения объема изделий ¦
+-----------------------+----------------------------------------+
¦Критическая концентра- ¦определяет уровень введения в продукт ¦
¦ция гелеобразования ¦белковых препаратов, обеспечивающий ¦
¦

<ПИСЬМО> МНС РФ от 24.04.2000 n ФС-8-03/1838 <О ПОРЯДКЕ ЗАЧИСЛЕНИЯ НАЛОГОВ И СБОРОВ, ПОСТУПАЮЩИХ В ФЕДЕРАЛЬНЫЙ И ТЕРРИТОРИАЛЬНЫЕ ДОРОЖНЫЕ ФОНДЫ>  »
Постановления и Указы »
Читайте также