ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ДИФТЕРИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУ 4.2.698-98 (утв. Минздравом РФ 09.01.1998)


Утверждены
Главным государственным
санитарным врачом
Российской Федерации -
Первым заместителем
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
9 января 1998 года
Дата введения - 8 июня 1998 года
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ДИФТЕРИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУ 4.2.698-98
1. Разработаны сотрудниками Федеральной референс - лаборатории диагностики дифтерийной инфекции Московского научно - исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского (д.м.н. Мазуровой И.К., к.м.н. Мельниковым, к.б.н. Комбаровой С.Ю., Борисовой О.Ю.) и Департаментом Госсанэпиднадзора Минздрава России (Жилиной Н.Я.).
2. Утверждены и введены в действие главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации от 8 апреля 1998 г.
3. Введены взамен Методических указаний 4.2.589-96 "Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции".
1. Область применения
Методические указания составлены в помощь специалистам бактериологических лабораторий санитарно - эпидемиологичоской службы, лечебно - профилактических учреждений и научно - исследовательских институтов для совершенствования лабораторной диагностики дифтерийной инфекции.
2. Характеристика возбудителя дифтерийной инфекции
Возбудителем дифтерийной инфекции являются токсигенные Corynebacterium diphtheriae. Нетоксигенные коринебактерии дифтерии не вызывают дифтерийную инфекцию. "Этиологическая" значимость этих микроорганизмов при неинфекционной патологии (фарингит, артрит, эндокардит и др.) требует специальных доказательств. При выделении нетоксигенных штаммов С.diphtheriae от больных с подозрением на дифтерийную инфекцию следует обратить внимание на правильность проведения бактериологического исследования и оценку токсигенных свойств.
В основе способности С. diphtheriae вырабатывать экзотоксин лежит феномен фаговой (или лизогенной) конверсии. Конверсия нетоксигенных штаммов С. diphtheriae в токсигенные и наоборот воспроизводится только в особых, экспериментальных условиях. В тех случаях, когда при первичном посеве исследуемого материала от больных дифтерией выделяют токсигенные, а при повторных обследованиях после лечения антибиотиками - нетоксигенные коринебактерии дифтерии, можно предположить, что при использовании антибиотиков в первую очередь исчезают токсигенные штаммы, как более чувствительные к их действию, а нетоксигенные штаммы продолжают выделяться. Такое же положение может создаваться и при санации антибиотиками бактерионосителей, одновременно выделяющих токсигенные и нетоксигенные коринебактерии дифтерии. Обнаружение у таких носителей при повторных обследованиях только нетоксигенных штаммов нельзя трактовать как утрату способности штаммов продуцировать экзотоксин.
Таксономически близкими виду С.diphtheriae являются C.ulcerans и C.pseudotuberculosis (C.ovis). Данные микроорганизмы - природные патогены крупного и мелкого рогатого скота, лошадей. Отмечена способность этих видов бактерий вырабатывать токсин, подобный дифтерийному. Встречаются и "нетоксигенные" штаммы. Известны случаи выделения "токсигенных" C.ulcerans при клинической картине заболевания, сходной с дифтерией.
На слизистых оболочках ротоглотки и носа в норме часто встречается ложнодифтерийная палочка Гофмана (C.pseudodiphtheriticum). Умение выделять и идентифицировать данные бактерии служит критерием оценки качества работы бактериологов в межэпидемический период.
Все микроорганизмы рода Corynebacterium являются грамположительными палочками, не образующими спор, обладающими различной степенью полиморфизма. Большинство видов лучше растет в аэробных условиях.
Обычно колонии микроорганизмов из рода коринебактерий на плотных питательных средах (например, на кровяном агаре) имеют серовато - белую или желтоватую окраску, непрозрачные или полупрозрачные, округлой формы, диаметром 1 - 3 мм. Чаще всего они бывают мягкой, маслянистой консистенции, хотя некоторые виды рода коринебактерии могут образовывать шероховатые R-колонии. Представители этого рода не отличаются высокой ферментативной активностью. C.diphtheriae растут при 37° C, устойчивы к низкой температуре, чувствительны к высокой. Все дезинфицирующие вещества в обычных концентрациях (3 - 5%) уничтожают коринебактерии дифтерии в течении 20 - 30 минут. Токсигенные C.diphtheriae более чувствительны к антибиотикам, чем нетоксигенные. Возможно появление устойчивых к антибиотикам штаммов. Широко определять чувствительность к антибиотикам штаммов, выделенных от бактерионосителей, не следует из-за несоответствия результатов лабораторной пробы с действием антибиотиков на возбудителя дифтерии в организме человека.
Для C.diphtheriae характерен значительный полиморфизм - разнообразие размеров и формы клеток. Клетки имеют форму булавы, ракетки, овода и т.д. Взаиморасположение клеток напоминает римские цифры X, V. При окраске часто обнаруживается выраженная внутриклеточная исчерченность, что объясняется наличием зерен волютина. Описано сродство волютина к метиленовому синему и, при обработке этим красителем, гранулы или полоски (скопления гранул) прокрашиваются в синий цвет, а протоплазма в отдельных случаях может приобрести розовый оттенок. Использование в бактериологической практике окраски по Граму является нецелесообразным, поскольку клетки C.diphtheriae легко обесцвечиваются спиртом и могут выглядеть в мазке грамвариабельными или даже грамотрицательными.
Для C.ulcerans и C.pseudodiphtheriticum характерна склонность к параллельному расположению клеток. 24 - 48-часовые культуры этих видов имеют чаще всего овоидную форму клеток.
По форме колоний и некоторым биохимическим свойствам C.diphtheriae подразделяют на культурально - биохимические варианты - gravis, mitis, intermedius.
Через 48 - 72 часа роста вариант mitis образует колонии S-типа - гладкие, диаметром 1 - 2 мм; S-R-колонии варианта gravis обычно выпуклые, с приподнятым центром, диаметром 2 - 3 мм; колонии варианта intermedius - S-типа, мелкие, плоские, гладкие, с ровным краем, диаметром 0,5 - 1 мм. Далее описываются только два культурально - биохимических варианта - gravis и mitis, так как биовар intermedius встречается редко и по биохимическим свойствам не отличается от биовара mitis.
На кровяных теллуритовых средах через 48 часов роста колонии C.diphtheriae варианта gravis, как и колонии C.ulcerans, черные, матовые имеют радиальную исчерченность. Колонии C.pseudodiphtheriticum имеют характерный светлый ободок.
В бактериологической практике опираться только на морфологические свойства колоний или микробной клетки, при идентификации C.diphtheriae, не представляется возможным. Описаны случаи бактериологической гипо- и гипердиагностики (в 55% и 14,5% случаев соответственно), когда используется учет только морфологических признаков. При идентификации C.diphtheriae необходимо использовать комплекс тестов, в первую очередь, определение патогенности (токсигенности), основного признака возбудителя дифтерии.
Определение токсигенных свойств проводится бактериологами в первые сутки роста подозрительных колоний на чашках первичного посева материала. Во избежание ошибок при определении токсигенных свойств коринебактерий, необходимо изучать данный признак у максимального числа выросших колоний с чашек первичного посева. При соблюдении описанных ниже методик можно изучить токсигенность более чем у 20 подозрительных колоний из одного анализа. Нельзя изучать материал при множественном росте подозрительных колоний только в одной - двух бляшках.
Ферментативная активность микроорганизмов изучается путем определения ферментов цистиназы, уреазы, способности расщеплять до кислоты глюкозу, сахарозу, крахмал. В редких случаях, когда необходимо идентифицировать C.ulcerans, добавляется тест на восстановление нитратов в нитриты.
Учитывая, что при идентификации возбудителя дифтерийной инфекции ведущим элементом является определение наличия токсина, оценки других свойств имеет вспомогательное значение. Использование "длинного" углеводного ряда является излишним при идентификация C.diphtheriae. Практическим бактериологам, занимающимся лабораторной диагностикой дифтерии, не требуется проводить идентификацию до вида других микроорганизмов рода Corynebacterium. В то же время, в лабораториях, где проводится диагностика заболеваний, вызываемых "недифтерийными" коринебактериями, недостаточно использования даже "длинного" углеводного ряда. Для точной идентификации данных микроорганизмов необходимо использовать хемотаксономические методы исследования, например, такие, как определение наличия миколовых кислот в составе клеточной стенки бактерий и некоторые другие.
Таким образом, выделенный микроорганизм является возбудителем дифтерии, если он обладает токсигенными свойствами, определенным спектром ферментативной активности (расщепление глюкозы, крахмала, отсутствие разложения сахарозы, наличие фермента цистиназы, отсутствие фермента уреазы) и характерными морфолого - культуральными признаками (образование колоний черного или серого цвета на кровяно - теллуритовых средах, с учетом, при необходимости, морфологии клеток - полиморфные, не образующие спор палочки).
3. Бактериологическое исследование
Бактериологическое исследование проводят с целью лабораторной диагностики дифтерийной инфекции, выявления источников инфекции и наблюдения за распространенностью токсигенных коринебактерии дифтерии.
ВЗЯТИЕ И ДОСТАВКА МАТЕРИАЛА
1. Успех бактериологического исследования в значительной степени зависит от своевременного и правильного взятия материала.
2. Взятие материала должны производить специально обученные медицинские работники лечебно - профилактических учреждений.
3. При исследовании на дифтерию обследуют ротоглотку и нос. При дифтерии редких локализаций (глаз, ухо, рана, кожа, влагалище) помимо пораженных участков, следует брать материал также с миндалин и из носа.
4. Взятие материала осуществляют с помощью стерильных ватных сухих тампонов. Для их приготовления используют деревянные или металлические (из нержавеющего металла) палочки, на один из концов которых плотно накручивается слой гигроскопической ваты (примерно 120 мг ваты на тампон). Тампоны должны иметь форму "капли", а не "веретена". Тампоны монтируют в пробирки с корковыми или ватными пробками так, чтобы конец тампона не касался дна и стенок пробирки. Стерилизуют тампоны в сухожаровом шкафу при температуре 140° C в течение часа или в автоклаве при 0,5 атм. 30 мин.
5. Материал из ротоглотки и носа берут отдельными тампонами, натощак или не ранее, чем через два часа после еды, при хорошем освещении, с использованием шпателя, не касаясь тампоном языка и внутренних поверхностей щек и зубов. Одним тампоном собирают материал с пораженных участков ротоглотки - миндалин, а при необходимости - с дужек мягкого неба, небного язычка или задней стенки глотки. При наличии налетов, материал следует брать с границы пораженных и здоровых тканей, слегка нажимая на них тампоном. Для взятия материала из носа используют другой тампон, который вводят сначала в один, а потом в другой носовой ход, не касаясь крыльев носа снаружи.
6. При ларингоскопии материал (слизь, пленка) собирают непосредственно из гортани. Материал с пораженных участков кожи следует собирать сухим тампоном после удаления корочек или струпа.
7. Тампоны должны быть доставлены в лабораторию не позднее 3-х часов с момента взятия материала. При проведении обследования контингентов в отдаленных от бактериологических лабораторий районах, рекомендуется засевать материал на чашки с питательной средой или использовать транспортную среду.
8. В случае использования транспортной среды материал собирают сухим тампоном, опускают в пробирку со средой и следят за тем, чтобы пробка тампона не намокла. Следует учитывать, что применение транспортной среды увеличивает срок выдачи окончательного ответа на одни сутки.
9. Чашки (или пробирки с транспортной средой) с посевом исследуемого материала можно поместить для подращивания в термостат при 37° C на 15 - 18 часов, после чего доставить в лабораторию.
10. При транспортировке на дальние расстояния также можно использовать тампоны, предварительно пропитанные раствором глицерина. Тампон пропитывают 5-процентным раствором глицерина в дистиллированной воде, отжимают о стенки сосуда с раствором, укрепляют в пробирке так же, как сухой тампон и автоклавируют при 0,5 атм. в течение 30 мин.
11. Холодное время года исследуемый материал доставляют в баклабораторию в сумках - термосах, во избежание его замерзания.
12. В случае необходимости проведения постмортальных исследований на коринебактерии дифтерии, материал целесообразно брать с миндалин, гортани и полости носа, поскольку во внутренних органах возбудитель обнаруживается редко.
13. Каждой пробирке с исследуемым материалом (зев, нос или другая локализация) придается номер. В прилагаемом списке указывается номер пробирки, фамилия, имя (или инициалы), возраст, название учреждения, направляющего материал, или домашний адрес обследуемого, цель обследования (диагностическая с указанием диагноза, по эпидпоказаниям, профилактическое обследование), дата и время взятия материала.
ХОД ИССЛЕДОВАНИЯ. ПЕРВЫЙ ДЕНЬ
Посев материала.
Материал для исследования из ротоглотки, носа или других пораженных мест засевают раздельно на поверхность одной из рекомендуемых плотных питательных сред, разлитых в чашки Петри.
Посев от одного лица производят на одну чашку, используя при этом половину поверхности среды для посева материала из ротоглотки, а вторую - для посева материала из носа. При посеве материала с кожи или других мест добавляют еще одну чашку. Не допускается посев материала от нескольких лиц на одну чашку.
При посеве материал втирают в среду со всех сторон тампона на участке площадью 2 x 1 кв. см - формирование такой "площадки" является обязательным. Затем этим же тампоном засевают оставшуюся поверхность 1/2 чашки. Посев производят частыми неперекрывающимися штрихами, не отрывая тампон от поверхности питательной среды и не изменяя положения тампона. Такой метод посева позволяет засеять весь материал с тампона, получить изолированные колонии (чистую культуру) для дальнейшей идентификации непосредственно на чашке первичного посева, что сокращает длительность анализа на одни сутки. Засеянные чашки или пробирки с транспортной средой помещают в термостат при 37° C. Высев из транспортной среды производят на следующие сутки на плотную питательную среду тампоном, отжатым о стенки пробирки, или петлей, забирая материал из осадка.
Посев следует производить на чашки со средой, согретые при комнатной температуре или в термостате (15

ПОСТАНОВЛЕНИЕ Госкомстата РФ от 09.01.1998 n 2 ОБ УТВЕРЖДЕНИИ УНИФИЦИРОВАННОЙ СИСТЕМЫ ПОКАЗАТЕЛЕЙ, ХАРАКТЕРИЗУЮЩИХ СОЦИАЛЬНО-ЭКОНОМИЧЕСКОЕ ПОЛОЖЕНИЕ МУНИЦИПАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ  »
Постановления и Указы »
Читайте также