ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ЛЕВОМИЦЕТИНА (ХЛОРАМФЕНИКОЛА, ХЛОРМИЦЕТИНА) В ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ И ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.1.1912-04 (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 06.03.2004)


Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
6 марта 2004 года
Дата введения -
1 мая 2004 года
4.3. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ЛЕВОМИЦЕТИНА
(ХЛОРАМФЕНИКОЛА, ХЛОРМИЦЕТИНА) В ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОГО
ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ
ХРОМАТОГРАФИИ И ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.1.1912-04
1. Разработаны: ГУ НИИ питания РАМН (В.А. Тутельян, С.А. Хотимченко, С.А. Шевелева, В.К. Кирничная, Т.В. Киселева, Н.Г. Орлова, Н.Р. Ефимочкина, Н.В. Барбер), Московским государственным университетом им. М.В. Ломоносова (А.М. Егоров, А.Ю. Колосова, Ж.В. Самсонова).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Минздрава России.
3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г. Онищенко 6 марта 2004 г.
4. Введены в действие 1 мая 2004 г.
5. Введены впервые.
1. Назначение и область применения
Настоящие Методические указания предназначены для учреждений госсанэпидслужбы Минздрава РФ и других ведомств, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов в соответствии с СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов".
Методические указания распространяются на методы с различным целевым назначением (арбитраж, скрининг). Два метода определения остаточных количеств левомицетина (хлорамфеникола, хлормицетина) в продуктах животного происхождения:
I - высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ);
II - иммуноферментного анализа (ИФА).
2. Общие положения
Среди ряда веществ, которые могут контаминировать продовольственное сырье и пищевые продукты, важное место занимают ветеринарные препараты, используемые как для лечения животных, так и в качестве стимуляторов роста. Сильнодействующими лекарственными препаратами, используемыми в ветеринарии, остаются антибиотики. Известно большое число антибиотиков, обладающих различными свойствами, механизмом и спектром действия, распределением в организме животных, характером метаболизма и т.д.
Систематическое поступление в организм человека антибиотиков с продуктами питания крайне вредно, поскольку они могут оказывать нежелательные эффекты, чаще всего в виде возникновения аллергических реакций, дисбактериозов, подавлять активность некоторых ферментов, изменять микрофлору кишечника, способствовать распространению устойчивых форм микроорганизмов и т.д. Следует учитывать возможность отрицательного влияния антибиотиков в сырье для пищевой промышленности на проведение ряда технологических процессов в переработке мяса, рыбы, молока (в частности, при получении кисломолочных продуктов) и других продуктов. Кроме того, наличие антибиотиков может затруднять бактериологические исследования качества продуктов животного происхождения.
Хлорамфеникол (далее - ХАФ) является антибиотиком широкого спектра действия, обладающим высокой активностью в отношении бактерий и риккетсий. В отличие от многих антибиотиков ХАФ обладает довольно простым химическим строением.
Хлорамфеникол малорастворим в воде, но хорошо в спирте. Установлено, что ХАФ медленно выводится из организма животных и сравнительно долго сохраняет свою активность при хранении продуктов.
В настоящее время для определения ХАФ в продуктах питания применяют ряд методов, в их числе микробиологические методы, которые являются сравнительно простыми и дешевыми, однако отличаются недостаточной специфичностью и воспроизводимостью результатов.
Для арбитражных исследований вводятся хроматографические методы, в частности ВЭЖХ, позволяющий раздельно определять как ХАФ, так и его метаболиты.
Количественный метод определения ХАФ при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии в сельскохозяйственных продуктах отличается низким пределом обнаружения (0,01 мг/кг), хорошей воспроизводимостью (относительное стандартное отклонение 0,15 - 0,21) и надежностью.
Для скрининговых целей в мире широко применяют методы иммунохимического анализа, обеспечивающие высокую чувствительность, специфичность и точность. Для контроля пищевой продукции предпочтение отдается методам твердофазного иммуноферментного анализа, которые являются высокочувствительными (предел обнаружения - 0,00008 мг/кг).
Методические указания предназначены для учреждений госсанэпидслужбы Минздрава РФ и других ведомств, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов. Согласно СанПиН 2.3.2.1078-01 содержание левомицетина в продуктах животного происхождения не допускается.
3. Отбор и подготовка проб
Отбор и подготовка проб аналогичны для обоих методов исследования.
Отбор продуктов питания осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТов на исследуемые продукты: ГОСТ 7269-79 "Мясо", ГОСТ 7202.0-74 "Мясо птицы", ГОСТ 3622-68 "Молоко и молочные продукты".
Отобранные образцы продуктов герметично упаковывают в полиэтиленовые мешки, стеклянные банки с притертыми крышками или укладывают в коробки. Образцы доставляют в лабораторию для анализа сразу же после отбора проб или, в случае необходимости, хранят на холоде, а для скоропортящихся продуктов осуществляют замораживание -4 - -10 °С, используя для этой цели холодильники или соответствующие приспособления.
К исследованию скоропортящихся образцов следует приступать в день их доставки в лабораторию. При отсутствии такой возможности образцы должны хранить при указанной выше температуре не более двух недель со времени отбора среднего образца.
4. Определение остаточных количеств
левомицетина (хлорамфеникола, хлормицетина)
в продуктах животного происхождения методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии
4.1. Принцип метода
Метод основан на извлечении хлорамфеникола экстракцией этилацетатом, последовательной промывке экстракта разбавленным раствором щелочи и кислоты, обезжиривании петролейным эфиром и хроматографическом разделении с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в обращенно-фазном варианте.
4.2. Аппаратура, материалы, реактивы
Жидкостный хроматограф с УФ детектором,
длина волны 278 нм, любой марки
Колонка с обращенной фазой (ODS, С18) длина
25 см, диаметр 4,6 мм, диаметр сорбента 5 мкм
Гомогенизатор тканей ГОСТ 15906
Центрифуга настольная
или аналогичная ТУ 5.375-4261
Ротационный испаритель с ловушкой ТУ 25-11-917
Азот, поверочный нулевой газ ГОСТ 9293-74
Весы технические ГОСТ 19491
Весы аналитические ГОСТ 24104-88Е
Цилиндры мерные, объемом 50 и 100 куб. см ГОСТ 1770
Колбы плоскодонные на 50 и 100 куб. см
НШ N 14,5 ТУ 48-52
Колбы мерные на 25, 50 и 100 куб. см ГОСТ 1770
Пипетки 1,0, 2,0, 5 и 10 куб. см ГОСТ 29227-91
Колбы для упаривания с круглым или
коническим дном на 50 и 100 куб. см с НШ
N 14,5 ГОСТ 10394
Воронка делительная на 100 куб. см ГОСТ 2536
Натрий серно-кислый, безводный ГОСТ 4166
Этилацетат, хч ГОСТ 5.1070
Натрий хлористый, насыщенный раствор в воде ГОСТ 4233
Гидроокись натрия, хч
10%-ный раствор щелочи (NaOH, КОН)
Уксусная кислота ГОСТ 61-75
10%-ный раствор уксусной кислоты
Серная кислота ГОСТ 14262-78
Калий фосфорно-кислый однозамещенный
0,025 М раствор КН РО ТУ 6-09-5324-87
2 4
Ацетонитрил ТУ 6-09-3534
Петролейный эфир, фракция 40 - 70 °С
Метанол (спирт метиловый)
Дециламин, импорт. ГОСТ 6995-77
Вода дистиллированная ГОСТ 6709
Левомицетина сукцинат растворимый
4.3. Требования техники безопасности
при проведении испытаний
Помещение, в котором проводится определение хлорамфеникола, должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Все операции анализа необходимо проводить в вытяжном шкафу с использованием индивидуальных средств защиты.
4.4. Подготовка к испытанию
4.4.1. Приготовление растворов
Взвешивают 25 мг левомицетина, помещают в мерную колбу на 25 куб. см и растворяют в метаноле, концентрация левомицетина 1 мг/мл. В мерную колбу на 25 куб. см помещают 0,25 куб. см полученного раствора и разбавляют метанолом до метки. Концентрация левомицетина в стандартном растворе 10 нг/мкл.
4.5. Проведение испытания методом ВЭЖХ
4.5.1. Подготовка образца для определения левомицетина в
молоке
Смешивают 25 куб. см молока с 12 г безводного сульфата натрия
и экстрагируют (3 раза по 15 куб. см этилацетата). Полученную
смесь центрифугируют 15 мин. со скоростью 4000 об./мин. и
декантируют. Этилацетатный слой промывают последовательно 5 куб.
см насыщенного раствора NaCl с добавлением в него 0,2 куб. см 10%
NaOH; 5 куб. см насыщенного раствора NaCl с добавлением 0,2 куб.
см 10% СН СООН; 5 куб. см насыщенного раствора NaCl. Органический
3
слой отбирают и упаривают на ротационном испарителе (при 50 °С) до
возможно минимального объема, отдувают азотом до исчезновения
запаха органических растворителей, добавляют 3 куб. см смеси
ацетонитрил-вода (1:4) и экстрагируют 3 раза по 5 куб. см
петролейным эфиром. Петролейный эфир отбрасывают и извлекают
левомицетин экстракцией этилацетатом (3 раза по 5 куб. см).
Этилацетатный слой упаривают досуха, растворяют в 0,1 куб. см
метанола.
4.5.2. Подготовка образца для определения левомицетина в мясе
Гомогенизируют 10 г мяса с 15 куб. см фосфатного буфера (0,025
М КН РО + 0,025 М Na HPO ) рН = 6,88 и экстрагируют 3 раза по 30
2 4 2 4
куб. см этилацетата. Полученную взвесь центрифугируют 15 мин. при
4000 об./мин. и декантируют этилацетатный слой, промывают
последовательно 5 куб. см насыщенного раствора NaCl с добавлением
0,2 мл 10%-ного NaOH; 5 мл насыщенного раствора NaCl с добавлением
0,2 мл 10%-ного СН СООН и 5 куб. см насыщенного раствора NaCl.
3
Органический слой отбирают и упаривают на ротационном испарителе
(при 50 °С) до возможно минимального объема, отдувают азотом до
исчезновения запаха органических растворителей, добавляют 3 куб.
см смеси ацетонитрил-вода (1:4) и экстрагируют 3 раза по 5 куб. см
петролейного эфира, петролейный эфир отбрасывают и извлекают
левомицетин экстракцией этилацетатом (3 раза по 5 куб. см).
Этилацетатный слой упаривают досуха, растворяют в 0,1 куб. см
метанола.
4.5.3. Подготовка образца для определения левомицетина в яйцах
Перетирают 10 г гомогената яйца с 5 г Na SO , приливают 40
2 4
куб. см этилацетата и 5 куб. см 1Н H SO , перемешивают и
2 4
центрифугируют 5 - 10 мин. при 4000 об./мин., этилацетатный слой
декантируют, водную часть экстрагируют последовательно 30 и 20
куб. см этилацетата, при необходимости применяя центрифугирование
для расслоения. Объединенные этилацетатные слои промывают
последовательно 10 куб. см 2-процентного раствора Na CO
2 3
насыщенного NaCl; 10 куб. см насыщенного раствором NaCl.
4.6. Условия хроматографирования (ВЭЖХ)
В жидкостной хроматограф с колонкой (Ультрасфер ODS, С ) 5
18
мкм (250 х 4,6 мм), УФ детектором при лямбда = 278 нм, используя
элюент ацетонитрил-вода-дециламин (40:60:0,1), вводят 5 мкл
стандартного раствора (10 нг/мкл) левомицетина. В тех же условиях
вводят метанольный экстракт образца (молока, мяса, яиц).
4.7. Подтверждение наличия левомицетина в образцах
Для подтверждения наличия левомицетина к 50 мкл метанольного экстракта приливают 50 мкл 10%-ного раствора КОН и нагревают 20 мин. при 70 °С, 10 мкл полученного раствора вводят в тех же условиях в колонку жидкостного хроматографа. На полученной хроматограмме пик с временем удерживания левомицетина отсутствует. Это подтверждает наличие левомицетина в образце.
4.8. Обработка результатов
4.8.1. За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Окончательный результат округляют до второго десятичного знака.
Таблица 1
МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ХЛОРАМФЕНИКОЛА В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
(МОЛОКЕ, МЯСЕ, ЯЙЦАХ)
--------------------------------------T--------------------------¬
¦ Статистический параметр ¦Соединение - хлорамфеникол¦
+-------------------------------------+--------------------------+
¦Нижний предел определения, мг/кг ¦0,01 ¦
+-------------------------------------+--------------------------+
¦Интервал надежного определения, мг/кг¦0,01 - 10,0 ¦
+-------------------------------------+--------------------------+
¦Среднее значение открываемости ¦95,5 ¦
¦(показатель правильности), % ¦ ¦
+-------------------------------------+--------------------------+
¦Допустимое расхождение между резуль- ¦7,0 ¦
¦татами двух параллельных определений ¦ ¦
¦хлорамфеникола, полученными в одной ¦ ¦
¦лаборатории в одной серии измерений

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ. МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ (ГМИ) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ БИОЛОГИЧЕСКОГО МИКРОЧИПА. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.1903-04 (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 06.03.2004)  »
Постановления и Указы »
Читайте также