ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ. МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ (ГМИ) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ БИОЛОГИЧЕСКОГО МИКРОЧИПА. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.1903-04 (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 06.03.2004)


Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
6 марта 2004 года
Дата введения -
с момента утверждения
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ. МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ
ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ (ГМИ) РАСТИТЕЛЬНОГО
ПРОИСХОЖДЕНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ БИОЛОГИЧЕСКОГО МИКРОЧИПА
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.1903-04
1. Разработаны: Институтом физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН и Институтом молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.
2. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г. Онищенко 06.03.04.
3. Введены впервые.
1. Область применения
Настоящие Методические указания распространяются на пищевое сырье (в т.ч. посевной и посадочный материал), пищевые продукты, цветы (далее - продукт) и устанавливает метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с использованием биологического микрочипа.
Метод основан на асимметричной мультиплексной полимеразной
цепной реакции (далее - амПЦР) с последующей гибридизацией
продуктов этой амПЦР на биологическом микрочипе. Метод
одновременно устанавливает наличие или отсутствие в анализируемой
пробе не менее пяти различных трансгенных последовательностей ДНК.
-12
Чувствительность метода - не менее 10 г (1 пг) ДНК.
Методические указания предназначены для применения в лабораториях учреждений санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации, осуществляющей контроль за качеством продовольственного сырья и пищевых продуктов, в т.ч. импортируемых в Российскую Федерацию, гигиеническую оценку и выдачу санитарно-эпидемиологических заключений, в лабораториях других организаций, аккредитованных в установленном порядке на право проведения контроля безопасности пищевой продукции и продовольственного сырья.
2. Нормативные ссылки
В настоящих Методических указаниях использованы ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 12.1.004-91. Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.007-76. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.019-79. Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
ГОСТ 12.4.009-83. Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание
ГОСТ 12.4.021-75. Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования
ГОСТ 1770-74. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 3118-77. Кислота соляная. Технические условия
ГОСТ 3164-78. Масло вазелиновое медицинское. Технические условия
ГОСТ 4233-77. Натрий хлористый. Технические условия
ГОСТ 4328-77. Натрия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 6709-72. Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 9284-75. Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия
ГОСТ 9805-84. Спирт изопропиловый. Технические условия
ГОСТ 12026-76. Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ 12738-77. Колбы стеклянные с градуированной горловиной. Технические условия
ГОСТ 13646-68. Термометры стеклянные ртутные для точных измерений. Технические условия
ГОСТ 21400-75. Стекло химико-лабораторное. Технические требования. Методы испытаний
ГОСТ 24104-01. Весы лабораторные. Общие технические требования
ГОСТ 25336-82. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 26678-85. Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81). Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Ч. 1. Общие требования
ГОСТ Р 51652-00. Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия.
3. Определения
В настоящих Методических указаниях применяют следующие термины с соответствующими определениями:
3.1. Биологическая безопасность - в соответствии с Прилож. А.
3.2. Генетически модифицированные источники: сырье и пищевые продукты (компоненты), используемые человеком в натуральном или переработанном виде, полученные из генетически модифицированных организмов или содержащие их в своем составе.
3.3. Генетически модифицированный организм: организм, генетический материал которого изменен с применением методов генной инженерии.
3.4. Генная инженерия: совокупность приемов, методов и технологий, в т.ч. технологий получения рекомбинантных нуклеиновых кислот, по выделению генов из организма, осуществлению манипуляций с генами и введению их в другие организмы.
3.5. Биологический микрочип: микроматрица с ячейками, в которых иммобилизован набор олигонуклеотидов.
3.6. Праймер: последовательность однотяжевой ДНК длиной до 25 нуклеотидов, применяемая для проведения асимметричной мультиплексной полимеразной цепной реакции.
3.7. Асимметричная мультиплексная полимеразная цепная реакция: полимеразная цепная реакция, где в одной пробирке с участием нескольких пар праймеров одновременно амплифицируются разные последовательности анализируемой ДНК, причем количество одного из праймеров каждой пары в несколько раз превышает количество другого праймера.
4. Аппаратура, материалы и реактивы
4.1. Компьютерная программа "Imageware" для анализа изображений, полученных с помощью "Чипдетектора-03" [1].
4.2. Комплекс аппаратно-программный для анализа флуоресценции биологических микрочипов типа "Чипдетектор-03" [2].
4.3. Амплификатор ДНК типа "Терцик" под микроцентрифужные пробирки вместимостью 0,2, 0,5 куб. см со скоростью нагрева/охлаждения активного элемента не менее 1,5 °С/с [3].
4.4. Термостат суховоздушный типа ТВЗ-25 с рабочей температурой 37 °С, рабочий диапазон от 20 до 60 °С, точность поддержания температуры +/- 1 °С [4].
4.5. Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 высокого класса точности с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более +/- 0,0001 г.
4.6. Камера морозильная по ГОСТ 26678, обеспечивающая температуру минус 20 °С.
4.7. Холодильник бытовой электрический по ГОСТ 26678.
4.8. Микроцентрифуга настольная типа 5415С с частотой вращения
-1
не менее 13000 мин. [5].
4.9. Мешалка магнитная с подогревом [6].
4.10. Аппарат для встряхивания типа CV-1500 с частотой
-1
вращения не менее 1500 мин. [7].
4.11. рН-метр с набором электродов, с погрешностью измерений +/- 0,1 рН.
4.12. Микродозаторы с переменным объемом дозирования: 0,5 - 10,0 куб. мм (шаг - 0,1 куб. мм, точность +/- 2,5 - 10,0%, воспроизводимость 3 - 7%); 5,0 - 50,0 куб. мм (шаг - 0,5 куб. мм, точность +/- 2,0 - 5,0%, воспроизводимость 2,5 - 5%); 20,0 - 200,0 куб. мм (шаг - 1,0 куб. мм, точность +/- 1,5 - 2,0%, воспроизводимость 2 - 3%); 100 - 1000 куб. мм (шаг - 5 куб. мм, точность +/- 1,0 - 1,5%, воспроизводимость 1 - 2%).
4.13. Штативы под микроцентрифужные пробирки типа RP-30 и RP-80 на 30 и 80 шт. [8].
4.14. Наконечники с фильтром для микродозаторов (микропипеток) с переменным объемом дозирования жидкостей до 10; 20; 200; 1000 куб. мм [9].
4.15. Пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф вместимостью 0,2; 0,5 и 1,5 куб. см стерильные.
4.16. Пестик или палочка стеклянные по ГОСТ 21400 для микроцентрифужных пробирок вместимостью 1,5 куб. см.
4.17. Цилиндры стеклянные мерные лабораторные по ГОСТ 1770 на 25, 100, 250 и 1000 куб. см.
4.18. Колбы стеклянные мерные плоскодонные конические по ГОСТ 25336 вместимостью 50 - 1000 куб. см.
4.19. Пипетки стеклянные градуированные по ГОСТ 29227.
4.20. Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.
4.21. Натрия гидроокись по ГОСТ 4328.
4.22. Кислота соляная концентрированная по ГОСТ 3118, хч.
4.23. Натрий хлористый по ГОСТ 4233, хч.
4.24. Этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль дигидрат (ЭДТА) [10].
4.25. Трис(оксиметил)аминометан [11].
4.26. Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652, хч.
4.27. Спирт изопропиловый по ГОСТ 9805, хч.
4.28. Додецилсульфат натрия (SDS) [12].
4.29. Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
4.30. Вода особо чистая стерильная, не содержащая ДНК, РНК и дезоксирибонуклеаз.
4.31. Фермент термостабильный Taq-полимераза, оптимум активности при 70 - 72 °С [13].
4.32. ПЦР буфер десятикратный (10х; 12,1 г в 1 куб. дм Трис-НСl, рН 8,8; 37,28 г в 1 куб. дм КСl, 5% Твин-20, 50% формамид; 142,83 мг в 1 куб. дм MgCl2.
4.33. Гуанидин тиоцианат [14].
4.34. М-[2-оксиэтил]пиперазин-N"-[2-этансульфоновая кислота] (HEPES) [15].
4.35. Масло вазелиновое медицинское по ГОСТ 3164.
4.36. Раствор водный дезоксирибонуклеозидтрифосфатов: дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ с концентрацией 2 мМ каждого [16].
4.37. Раствор заведомо трансгенной ДНК (около 100 нг/куб. мм
6
или 10 копий/куб. мм) [17].
4.38. Раствор заведомо нетрансгенной ДНК (около 100 нг/куб.
6
мм или 10 копий/куб. мм) [18].
4.39. Баня водяная [19].
4.40. Раствор водный праймеров "ПР-1" для амплификации
соответствующих участков генома, включающий следующие пары
праймеров:
праймеры на промотор 35S вируса мозаики цветной капусты:
35S_п 5" ССТ ССТ CGG ATT CCA TTG ССС AG (23 н.о.)
35S_оф 5" GTC CAT СТТ TGG GAC САС ТGТ CGG (24 н.о.);
праймеры на маркерный ген gus из бактерии Escherichia coli:
gus_п 5" AAG CCG GGC AAT TGC ТGТ GCC А (22 н.о.)
gus_оф 5" GAC CGC АТС GAA ACG CAG САС G (22 н.о.);
праймеры на промотор nos из агробактерии Agrobacterium
tumefaciens:
nos_п 5" CGA TGA CGC GGG АСА AGC CGT (21 н.о.)
nos_оф 5" GAC СТТ AGG CGA CTT TTG AAC GCG С (25 н.о.);
праймеры на маркерный ген npt II из транспазона Tn5
бактериального происхождения:
npt_п 5" GTG ТТС CGG CTG TCA GCG CAG G (22 н.о.)
npt_оф 5" CGC AAG GAA CGC CCG TCG TGG (21 н.о.);
праймеры на терминатор ocs из агробактерии Agrobacterium
tumefaciens:
ocs_п 5" GCG AGA CGC СТА TGA TCG CAT GAT (24 н.о.)
ocs_оф 5" GAA ACC GGC GGT AAG GAT CTG AGC (24 н.о.).
Примечание. В обозначениях праймеров индекс "_п" означает "прямой", индекс "_оф" означает "обратный флуоресцентномеченый"; н.о. - нуклеотидные остатки [20].
4.41. Биологический микрочип с иммобилизованными олигонуклеотидами, приведенными в табл. 1 [21].
Таблица 1
ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ, ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ
-----------------T--------------T--------------------------------¬
¦ Наименование ¦ Детектируемая¦ Последовательность ¦
¦ олигонуклеотида¦ мишень ¦ олигонуклеотида ¦
+----------------+--------------+--------------------------------+
¦35S_и ¦промотор 35S ¦5" GCC АТС ATT GCG ATA AAG G ¦
+----------------+--------------+--------------------------------+
¦gus_и ¦ген gus ¦5" CTG GTA TCA GCG CGA A ¦
+----------------+--------------+--------------------------------+
¦nos_и ¦промотор nos ¦5" GCT AAG CAC ATA CGT CAG AA ¦
+----------------+--------------+--------------------------------+
¦npt_и ¦ген npt II ¦5" GGC AGC GCG GCT АТС ¦
+----------------+--------------+--------------------------------+
¦ocs_и ¦терминатор ocs¦5" ТТС ТGТ ТGТ GСА СGТ ТGТ А ¦
+----------------+--------------+--------------------------------+
¦Примечание. Индекс "_и" означает "иммобилизованный". ¦
L-----------------------------------------------------------------
Биологический микрочип представляет собой стандартное предметное стекло по ГОСТ 9284 для световой микроскопии, на поверхности которого в определенном порядке расположены 10 микроскопических ячеек (рис. 1), заполненных полиакриламидным гелем. Каждая из пяти верхних ячеек содержит индивидуальный ковалентно иммобилизованный олигонуклеотид (35S, gus, nos, npt или ocs). Три ячейки с индексом "НК" не содержат ранее перечисленных индивидуальных ковалентно иммобилизованных олигонуклеотидов и выполняют роль отрицательного контроля гибридизации. Две ячейки с индексом "М" содержат ковалентно связанный флуоресцентный краситель и предназначены для однозначной ориентации биологического микрочипа. Поверхность биологического микрочипа с ячейками должна быть закрыта пластиковой крышкой с отверстиями, которая вместе с предметным стеклом образует замкнутое пространство, предназначенное для проведения гибридизации анализируемой пробы.
------------------------------------------¬
¦ --+---- 1
¦ --------¬ ¦
¦ ¦ 35S_и +---+---¬
¦ L-------- ¦ ¦
¦ ¦ ¦
¦ --------¬ --------¬ ¦ ¦
----+----------------+ gus_и ¦ ¦ nos_и +---+---+
¦ ¦ L-------- L-------- ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ --------¬ --------¬ ¦ ¦
+---+----------------+ npt_и ¦ ¦ osc_и +---+---+
2 -+ ¦ L-------- L-------- ¦ +- 2
+---+--------------------¬ ¦ ¦
¦ ¦ --------¬ ----+---¬ --------¬ ¦ ¦
+---+---+ НК ¦ ¦ НК ¦ ¦ НК +---+---+
¦ ¦ L-------- L-------- L-------- ¦ ¦
¦ ¦

САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ ЭКСПЕРТИЗА БЕНЗИНОМОТОРНЫХ ПИЛ И ОРГАНИЗАЦИЯ РАБОТ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 2.2.2.1843-04 (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 06.03.2004)  »
Постановления и Указы »
Читайте также