МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ (ГМИ) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.1913-04 (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 06.03.2004)


Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
6 марта 2004 года
Дата введения
с момента утверждения
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ (ГМИ)
РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.1913-04
1. Разработаны: ГУ НИИ питания РАМН (В.А. Тутельян, Е.Ю. Сорокина, О.Н. Чернышева, А.Б. Левицкая), ГУ ЦНИИ эпидемиологии Минздрава России (Г.А. Шипулин, С.Б. Яцышина), Департамент госсанэпиднадзора Минздрава России (А.И. Петухов), Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России (Е.Н. Беляев, И.В. Брагина, Т.В. Воронцова, Т.Н. Потапова, Т.Ф. Авдеенко, С.Ю. Терехова, М.В. Зароченцев), Центр "Биоинженерия" РАН (К.Г. Скрябин, Д.Б. Дорохов, Б.Б. Кузнецов).
2. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 06.03.04.
3. Введены впервые.
1. Область применения
1.1. Настоящие Методические указания устанавливают методы определения количественного содержания ГМИ растительного происхождения в пищевой продукции.
1.2. Методические указания предназначены для применения в лабораториях учреждений санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации, осуществляющих контроль за качеством продовольственного сырья и пищевых продуктов, в т.ч. импортируемых в Российскую Федерацию, гигиеническую оценку и выдачу санитарно-эпидемиологических заключений, лабораториях других организаций, аккредитованных в установленном порядке на право проведения контроля безопасности пищевой продукции и продовольственного сырья.
1.3. Методические указания являются обязательными при контроле пищевых продуктов на наличие генетически модифицированных источников и применяются на этапах поставки на производство, гигиенической экспертизы, государственной регистрации, закупки, ввоза в страну и реализации.
1.4. Методические указания разработаны с целью обеспечения единого методического подхода для количественного контроля генетически модифицированных источников в пищевых продуктах, продовольственном сырье, пищевых и биологически активных добавках к пище.
2. Общие положения
Методические указания содержат описание методов определения количественного содержания ГМИ растительного происхождения в пищевых продуктах, основанных на идентификации рекомбинантной ДНК с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией в режиме реального времени (RealTime PCR).
Описанные методы направлены на выявление регуляторной последовательности промотора 35S из вируса мозаики цветной капусты. Определение количественного содержания этой регуляторной последовательности параллельно с определением количественного содержания референсной последовательности генома растения позволяет проводить анализ количественного содержания ГМИ (в %). Окончательное количественное определение ГМИ в пищевой продукции, разрешенных для реализации населению и использования в пищевой промышленности в Российской Федерации, проводится с применением методов исследований для конкретных трансформационных событий, описание которых представляются разработчиком в Минздрав России.
В Методических указаниях представлены методы определения генетических конструкций для наиболее часто встречаемых на мировом и внутреннем продовольственном рынках генетически модифицированных растений.
Представленные методы состоят из следующих этапов: выделение ДНК из пищевого продукта, проведение амплификации с детекцией в режиме реального времени с использованием специального оборудования, проведение анализа результатов амплификации, расчет процентного содержания генетически модифицированных источников и оформление результатов в документах.
Метод количественного определения сои линии 40-3-2, являющейся доминирующей генетически модифицированной культурой на мировом и внутреннем продовольственном рынках, основан на количественном иммуноферментном анализе модифицированного белка, определяющего устойчивость к глифосату.
Анализ пищевого продукта на содержание ГМИ включает на первом этапе качественное определение ГМИ методом полимеразной цепной реакции (идентификация рекомбинантной ДНК: промотор 35S и/или терминатор NOS). При получении положительного результата проводится определение конкретного ГМИ, который был использован при производстве исследуемого продукта, с целью выявления разрешенных и неразрешенных для реализации в Российской Федерации. В случае решения вопроса о маркировке продукта проводится количественное определение ГМИ (Прилож. 1).
3. Аппаратура, материалы и реактивы
3.1. Амплификаторы с оптической приставкой
типа Rotor Gene 3000, ABI-PRISM 7000 и другие
3.2. Холодильник бытовой электрический ГОСТ 26678
Камера морозильная, обеспечивающая
температуру минус 20 °С
3.3. Микроцентрифуга настольная типа
Эппендорф и другие (частота вращения
не менее 13000 об./мин.)
3.4. Термостат типа "TERMO 24-15" и другие
под пробирки типа Эппендорф вместимостью
1,5 мл, диапазон температур от 15 °С
до 120 °С, количество гнезд - не менее 20,
точность поддержания температуры - 0,2 °С,
разность температур между соседними
ячейками - не более 0,5 °С
3.5. Аппарат для встряхивания типа "Вортекс"
и другие (скорость вращения 250 - 3000
об./мин.)
3.6. Весы лабораторные общего назначения
2-го класса точности с наибольшим пределом
взвешивания 200 г ГОСТ 24104
3.7. Анализатор потенциометрический,
погрешность измерений рН +/- 0,01 ГОСТ 19881
3.8. Стерилизаторы паровые медицинские
или аналогичные ГОСТ 19569
3.9. Дистиллятор, обеспечивающий качество
дистиллированной воды ГОСТ 6709
3.10. Гомогенизатор перистальтического типа
"Стомайкер" или других моделей
3.11. Облучатель бактерицидный настенный
ОБН-150 или других видов ТУ 16-535
3.12. Дозаторы с переменным объемом
дозирования:
0,2 - 2,0 куб. мм с шагом 0,01 куб. мм,
с точностью +/- 1,2%;
0,5 - 10,0 куб. мм с шагом 0,01 куб. мм,
с точностью +/- 0,8%;
2 - 20 куб. мм с шагом 0,01 куб. мм,
с точностью +/- 0,8%;
20 - 200 куб. мм с шагом 0,1 куб. мм,
с точностью +/- 0,6%;
100 - 1000 куб. мм с шагом 1 куб. мм,
с точностью +/- 3%;
2 - 10 куб. см с шагом 0,1 куб. см,
с точностью +/- 0,5%
3.13. Пинцет медицинский ГОСТ 21241
3.14. Ножницы медицинские
3.15. Скальпель хирургический
3.16. Штативы для пробирок микроцентрифужных
типа Эппендорф вместимостью 0,2 куб. см,
1,5 куб. см
3.17. Ступка фарфоровая с пестиком
3.18. Шпатель под размер микроцентрифужной
пробирки вместимостью 1,5 куб. см
3.19. Бумага фильтровальная лабораторная ГОСТ 12026
3.20. Воронки стеклянные ГОСТ 25336
3.21. Колбы стеклянные мерные плоскодонные
конические вместимостью 25, 50, 100, 200,
1000 куб. см ГОСТ 12738
3.22. Цилиндры стеклянные мерные лабораторные
вместимостью 25, 100, 1000 куб. см ГОСТ 1770
3.23. Пробирки микроцентрифужные типа
Эппендорф вместимостью 0,2 куб. см,
1,5 куб. см
3.24. Наконечники с фильтром для дозаторов
с переменным объемом дозирования до:
10; 20; 200; 1000 куб. мм; 10 куб. см
3.25. Оптические 96-луночные планшеты типа
МicroАmp и другие
3.26. Оптические крышки типа MicroAmp и
другие
3.27. Оптические прозрачные адгезивные пленки
3.28. Оптические пробирки объемом 0,2 куб. см
3.29. Кислота соляная, хч ГОСТ 3118
3.30. Кислота борная, хч ГОСТ 9656
3.31. Натрия гидроокись, хда ГОСТ 4328
3.32. Натрий хлористый, хч ГОСТ 4233
3.33. Этилендиаминтетрауксусная кислота
(ЭДТА), хч ТУ 6-09-11-1721
3.34. Гексадецилтриметиламмониум бромид (СТАБ)
3.35. Трис(оксиметил)аминометан, хч ТУ 6-09-4292
3.36. Спирт этиловый ректификованный ГОСТ Р 51652
3.37. Спирт изопропиловый, хч ТУ 6-09-402-85
3.38. Хлороформ, хч ГОСТ 20015
3.39. Вода дистиллированная ГОСТ 6709
3.40. Вода деионизированная ОСТ 11.029.003
3.41. 2-меркаптоэтанол, хч ТУ 6-09-08-1024
Допускается использование другого оборудования, инструментов, лабораторной посуды и реактивов с аналогичными техническими характеристиками, разрешенных к применению в установленном порядке.
4. Отбор, хранение и подготовка проб
пищевых продуктов для анализа
Отбор проб проводят по государственным стандартам, устанавливающим порядок отбора проб для однородных групп пищевой продукции: ГОСТ 5904, 9163, 12292, 10852, 12430, 13979, 26313, 22617.0, 27668, 26312.1, 9792, 7631.
4.1. Отбор образцов
От партии сырья или сыпучих продуктов отбирают общую пробу следующим образом:
- от исследуемой партии сырья или сыпучих продуктов отбирают не менее 10 образцов проб (по 5 - 10 г) в одноразовый плотный полиэтиленовый пакет размером 20 х 30 см с использованием одноразовых хирургических перчаток и перемешивают, формируя общую пробу (50 - 100 г);
- из общей пробы отбирают среднюю пробу в 10 - 20 г, помещают в полиэтиленовый пакет с застежкой-молнией размером не более 10 x 15 см, который, в свою очередь, помещают в одноразовый плотный полиэтиленовый пакет размером 20 х 30 см, опечатывают и отправляют на анализ.
От партии продуктов плотной консистенции отбирают общую пробу весом 10 - 50 г в одноразовый плотный полиэтиленовый пакет с застежкой-молнией размером не более 10 х 15 см, используя одноразовые перчатки и фламбированные (выдержанные в 96%-ном этаноле и обожженные в пламени газовой горелки) инструменты, опечатывают и отправляют на анализ.
Пробы жидких продуктов отбирают в чистые емкости из стекла или пластика с герметично закрывающимися крышками объемом не более 50 куб. см, опечатывают и отправляют на анализ.
При отборе проб составляют акт отбора проб, который вместе с отобранной пробой отправляют в лабораторию.
4.2. Подготовка проб к анализу
Для подготовки проб необходимо использовать одноразовые полипропиленовые пробирки, ступки и пестики, предварительно обработанные хромовой смесью, и фламбированные инструменты - пинцеты, скальпели, ножницы.
Пробы сухих гранулированных и сыпучих продуктов отбирают в ступку по 3 - 5 г и растирают пестиком до гомогенного состояния.
Пробы плотных продуктов (сырых или подвергшихся кулинарной обработке) весом 3 - 5 г помещают в ступку, измельчают ножницами, затем растирают пестиком до гомогенного состояния.
Пробы продуктов консистенции крахмала весом 100 - 300 мг помещают в одноразовые пластиковые пробирки и добавляют 1,0 куб. см физиологического раствора. Для анализа необходимо 50 - 150 куб. мм образца.
Пробы жидкой консистенции отбирают автоматическими микродозаторами с одноразовыми наконечниками в одноразовые пробирки из полипропилена. Для анализа необходимо 50 - 150 мкл образца.
Из полученных гомогенатов и суспензий проводят выделение ДНК.
4.3. Условия хранения и транспортирования образцов
Образцы сырья и продуктов хранят в течение 1 месяца (при необходимости повторного анализа) согласно условиям, указанным производителем продукта питания. Образцы скоропортящихся продуктов хранят в замороженном состоянии (при температуре минус 20 °С) в течение 1 месяца (при необходимости повторного анализа).
Транспортирование образцов осуществляют при температуре, рекомендованной для хранения сырья или пищевого продукта. Длительность транспортирования не должна превышать сроков годности продукта.
5. Количественное определение рекомбинантной ДНК
методом ПЦР в режиме реального времени
Количественное определение рекомбинантной ДНК осуществляется методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием наборов реактивов, разрешенных к применению для этих целей в установленном порядке.
5.1. На примере метода, разработанного с использованием наборов TaqMan для анализа сои ("TaqMan GMO Soy Detection Kit") и кукурузы ("TaqMan GMO Maize Detection Kit"):
5.1.1. Метод выделения ДНК с помощью СТАБ (гексадецилтриметиламмониум бромид).
Приготовление растворов
СТАБ-буфер.
В мерную колбу вносят 4 г СТАБ; 16,4 г NaCl; 3,15 г ТРИС - НСl; 1,5 г Na2ЭДТА, добавляют 100 мл деионизированной воды, доводят рН раствора до 8,0 1 М NaOH, доводят объем деионизированной водой до 200 куб. см.
Хранить при 4 °С не более 6 месяцев.
Перед использованием раствор выдерживают при комнатной температуре или подогревают в термостате при температуре 65 °С до полного растворения осадка. Непосредственно перед использованием в приготовленный лизирующий буфер вносят 2-меркаптоэтанол из расчета 4 куб. мм на 1 куб. см лизирующего буфера и перемешивают.
СТАБ-осаждающий раствор.
В мерную колбу вносят 1 г СТАБ; 0,5 г NaCl, добавляют 100 куб. см деионизированной воды, доводят рН раствора до 8,0 1 М NaOH, доводят объем деионизированной водой до 200 куб. см.
Хранить при 4 °С не более 6 месяцев.
1,2 M NaCl.
Растворяют 7,0 г NaCl в 100 куб. см деионизированной воды, перемешивают.
Хранить в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре до 1 года.
Приготовленные растворы автоклавируют при 1 атм., 121 °С 15 - 20 мин. или фильтруют через мембраны Millipore 0,4 куб. мм.
70%-ный раствор этилового ректификованного спирта.
Смешивают 70 куб. см 96%-ного этилового ректификованного спирта с 26 куб. см деионизированной воды.
Хранить при температуре от 4 до 5 °С не более 2 мес. в темной склянке.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ (ГМИ) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.1902-04 (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 06.03.2004)  »
Постановления и Указы »
Читайте также