ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ (ГМИ) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.1902-04 (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 06.03.2004)


Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
6 марта 2004 года
Дата введения
с момента утверждения
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ
И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ
ИСТОЧНИКОВ (ГМИ) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДОМ
ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.1902-04
1. Разработаны: ГУ НИИ питания РАМН (В.А. Тутельян - руководитель, Е.Ю. Сорокина, О.Н. Чернышева, О.В. Анисимова); Департаментом госсанэпиднадзора Минздрава России (А.И. Петухов); Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России (Е.Н. Беляев, И.В. Брагина, Т.В. Воронцова, Т.Н. Потапова, Т.Ф. Авдеенко, С.Ю. Терехова, М.В. Зароченцев); Центром госсанэпиднадзора в г. Москве (Н.Н. Филатов, И.И. Пискарева, Н.Я. Салова, Е.В. Сизых); Московской медицинской академией им. Сеченова Минздрава России (Б.П. Суханов); Центром "Биоинженерия" РАН (К.Г. Скрябин, Д.Б. Дорохов, Б.Б. Кузнецов, Ю.Е. Асадова); МГУ прикладной биотехнологии Минобразования России (И.А. Рогов, Н.Г. Кроха, А.Ф. Валихов).
2. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации и введены в действие 06.03.04.
3. Введены впервые.
1. Введение
1.1. Настоящие Методические указания устанавливают методы идентификации ГМИ растительного происхождения в пищевой продукции.
1.2. Методические указания предназначены для применения в лабораториях учреждений санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации, осуществляющей контроль за качеством продовольственного сырья и пищевых продуктов, в т.ч. импортируемых в Российскую Федерацию, гигиеническую оценку и выдачу санитарно-эпидемиологических заключений, в лабораториях других организаций, аккредитованных в установленном порядке на право проведения контроля безопасности пищевой продукции и продовольственного сырья.
1.3. Методические указания являются обязательными при контроле пищевых продуктов на наличие генетически модифицированных источников и применяются на этапах поставки на производство, гигиенической экспертизы, государственной регистрации, закупки, ввоза в страну и реализации.
1.4. Методические указания разработаны с целью обеспечения единого методического подхода для идентификации генетически модифицированных источников в пищевых продуктах, продовольственном сырье, пищевых и биологически активных добавках к пище.
2. Область применения
Методические указания содержат описание методов определения ГМИ растительного происхождения в пищевых продуктах, основанных на идентификации рекомбинантной ДНК с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Описаны скрининговые методы, направленные на выявление регуляторных последовательностей: промотора 35S из вируса мозаики цветной капусты и терминатора NOS из Agrobactetium tumefaciens. Идентификация этих регуляторных последовательностей позволяет проводить предварительную проверку пищевой продукции на наличие ГМИ, но не определяет примененную генетическую конструкцию или конкретную линию растения (трансформационное событие), а также не может применяться при проведении количественного анализа содержания ГМИ. Окончательная идентификация ГМИ, разрешенных для реализации населению и использования в пищевой промышленности в Российской Федерации, проводится с применением протоколов исследований для конкретных трансформационных событий, которые представляются разработчиком в Департамент госсанэпиднадзора Минздрава России при проведении санитарно-эпидемиологической экспертизы. В Методических указаниях описаны методы идентификации генетических конструкций для наиболее часто встречаемых на мировом и внутреннем продовольственных рынках генетически модифицированных растений.
Методы, применяемые при отборе проб пищевых продуктов, выделения ДНК для проведения анализов, проведения электрофореза, документирования и анализа получаемых данных, а также вопросы организации рабочего места, являются обязательными к исполнению при проведении как скрининговых, так и идентификационных анализов.
С целью выявления наличия сои и кукурузы как традиционных, так и генно-модифицированных сортов в исследуемом пищевом продукте, а также проверки качества выделяемых из исследуемых образцов препаратов ДНК приведены методы идентификации последовательностей ДНК, специфичных для всех линий сои и кукурузы.
Все представленные методы являются качественными и состоят из следующих этапов: выделение ДНК из пищевого продукта, амплификация целевой ДНК с соответствующими праймерами, электрофорез продуктов амплификации в агарозном геле, документирование и анализ результатов.
3. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы
3.1. Аппаратура и инструменты
Амплификатор типа "Терцик МС-2" со скоростью
нагрева/охлаждения активного элемента не менее
1,5 °C/с
Прибор для горизонтального электрофореза типа
"Mini-Sub Cell GT System" с комплектом кювет
и гребенок
Источник напряжения типа "Power Рас 300"
с диапазоном регулируемого напряжения
50 - 300 В
ТМ
Видеосистема типа "Gel Doc 2000 ",
предназначенная для ввода в компьютер,
анализа и документирования изображений
люминисцирующих следов ДНК в гелях, окрашенных
бромистым этидием:
диапазон излучения 300 - 400 нм,
чувствительность - не менее 10 нг ДНК
(по бромистому этидию)
Холодильник бытовой электрический ГОСТ 26678
Камера морозильная, обеспечивающая температуру
минус 20 °C
Микроцентрифуга настольная типа Эппендорф
-1
(частота вращения не менее 13000 мин. )
Термостат типа "TERMO 24-15" под пробирки типа
Эппендорф вместимостью 0,5 и 1,5 мл, диапазон
температур от 15 до 120 °C, количество гнезд -
не менее 20 каждого типа, точность поддержания
температуры - 0,2 °C, разность температур
между соседними ячейками - не более 0,5 °C
Аппарат для встряхивания типа "Вортекс",
-1
скорость вращения 250 - 3000 мин.
Печь микроволновая (мощностью не менее 400 W)
Весы лабораторные общего назначения
2-го класса точности с наибольшим пределом
взвешивания 200 г ГОСТ 24104
Анализатор потенциометрический, погрешность
измерений рН +/- 0,01 ГОСТ 19881-74
Стерилизаторы паровые медицинские
или аналогичные ГОСТ 19569-89Е
Дистиллятор, обеспечивающий качество
дистиллированной воды ГОСТ 6709-72
Гомогенизатор перистальтического типа
"Стомайкер" или других моделей
Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150
или других видов ТУ 16-535-84
Дозаторы с переменным объемом дозирования:
0,2 - 2,0 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью
+/- 1,2%;
0,5 - 10,0 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью
+/- 0,8%;
2 - 20 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью
+/- 0,8%;
20 - 200 мкл с шагом 0,1 мкл, с точностью
+/- 0,6%;
100 - 1000 мкл с шагом 1 мкл, с точностью
+/- 3%;
2 - 10 мл с шагом 0,1 мл, с точностью
+/- 0,5%
Пинцет медицинский ГОСТ 21241-89
Допускается использование другой аппаратуры и инструментов с техническими характеристиками не хуже указанных выше, отечественного и зарубежного производства, разрешенных для применения в установленном порядке.
3.2. Лабораторная посуда и материалы
Бумага фильтровальная лабораторная ГОСТ 12026-76
Воронки стеклянные ГОСТ 25336-82
Колбы стеклянные мерные плоскодонные
конические вместимостью 25, 50, 100, 200,
1000 мл ГОСТ 12738-77
Цилиндры стеклянные мерные лабораторные
вместимостью 25, 100, 1000 мл ГОСТ 1770-74
Пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф
вместимостью 0,2; 0,5; 1,5 мл
Наконечники с фильтром для дозаторов с
переменным объемом дозирования до:
10; 20; 200; 1000 куб. мм; 10 куб. см
3.3. Реактивы
Кислота соляная, хч ГОСТ 3118-77
Кислота борная, хч ГОСТ 9656-75
Натрия гидроокись, чда ГОСТ 4328-77
Натрий хлористый, хч ГОСТ 4233-77
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), хч ТУ 6-09-11-1721-83
Гексадецилтриметиламмониум бромид (СТАВ).
Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma),
кат. N Н 5882
Трис (оксиметил) аминометан, хч ТУ 6-09-4292-76
Альбумин бычий сывороточный сухой (БСА).
Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma),
кат. N В 4287
Этидий бромистый, хч ТУ 6-09-13-452-75
Спирт этиловый ректификованный ГОСТ Р 51652-00
Спирт изопропиловый, хч ТУ 6-09-402-85
Масло вазелиновое медицинское ГОСТ 3164-78
Хлороформ, хч ГОСТ 20015-88
Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72
Вода деионизированная ОСТ 11.029.003-80
2-меркаптоэтанол, хч ТУ 6-09-08-1024-81
Термостабильный фермент Taq-полимераза,
оптимум работы в области 70 - 72 °C.
Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma),
кат. N Д 1806
Буфер для ПЦР с MgCl2.
Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma),
кат. N Р 2192
Агароза для электрофореза (тип П).
Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma),
кат. N А 6877
Маркер молекулярной массы ДНК.
Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma),
кат. N Р 1473
Стандартный образец состава генетически
немодифицированного источника пищи
растительного происхождения (Certified
Reference Material IRMM N 410R SB-0).
Корпорация "Сигма Алдрич" (Fluka),
кат. N 53198
Стандартный образец состава
генетически модифицированного источника пищи
растительного происхождения (Certified
Reference Material IRMM N 410R SB-5).
Корпорация "Сигма Алдрич" (Fluka),
кат. N 44386
Нуклеотиды:
- 2"-дезоксиаденозин-5"трифосфорной кислоты
тетранатриевая соль, тригидрат (АТФ).
Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma),
кат. N Д 4788
- 2"-дезоксицитидин-5"трифосфорной кислоты
тетранатриевая соль, тригидрат (ЦТФ).
Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma),
кат. N Д 4913
- 2"-дезоксигуанозин-5"трифосфорной кислоты
тетранатриевая соль, тригидрат (ГТФ).
Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma),
кат. N Д 5038
- 2"-дезокситимидин-5"трифосфорной кислоты
тетранатриевая соль, тригидрат (ТТФ).
Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma),
кат. N Т 9656
Праймеры на промотор 35S,
терминатор NOS, сою линии 40-3-2, кукурузу
линий MON 810 и Bt-176, ген cry III
(картофель), ген лектина (соя), ген зеина
(кукуруза). ЗАО "Синтол" (Россия)
http://www.syntol.ru
Допускается использование других реактивов с техническими характеристиками не хуже указанных выше, препараты импортного производства должны иметь международный сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000.
4. Подготовка к анализу
4.1. Приготовление растворов
Приготовление 1М Трис - HCl (рН 7,5)
В мерной колбе на 100 мл растворить 12,11 г Трис (оксиметил) аминометана (молекулярный вес 121) в 80 мл дистиллированной воды, довести рН концентрированной соляной кислотой до 7,5, затем довести объем раствора до метки деионизованной водой, перемешать, хранить при температуре -20 °C не более года.
Приготовление 5М NaCl
Растворить 29,22 г натрия хлористого (молекулярный вес 58,5) в 100 мл дистиллированной воды, перемешать, хранить в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре до 1 года.
Приготовление 30%-ной NaOH
Растворить 3 г натрия гидроокиси (молекулярный вес 40) в 7 мл дистиллированной воды.
Приготовление 0,5М ЭДТА (рН 8,0)
В мерной колбе на 100 мл растворить 18,62 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (молекулярный вес 372,2) в 80 мл дистиллированной воды. Раствором 30%-ной натрия гидроокиси довести рН раствора до 8,0, дистиллированной водой - объем раствора до метки, перемешать. Хранить в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре до 1 года.
Приготовленные растворы автоклавировать при 1 атм., 121 °C 15 - 20 мин. или фильтровать через мембраны Millipore 0,4 мкм.
Приготовление хлороформа, насыщенного водой
Смешать 100 мл хлороформа с 20 мл деионизированной воды и оставить на 24 ч для насыщения. Срок хранения при температуре от 4 до 5 °C - не более 6 мес.
Приготовление 70%-ного раствора этилового ректификованного спирта
Смешать 70 мл 96%-ного этилового ректификованного спирта с 26 мл деионизированной воды. Срок хранения при температуре от 4 до 5 °C - не более 2 мес.
Приготовление раствора БСА (20 мкг/мл)
Растворить 0,002 г сухого альбумина бычьего сывороточного в 1 мл деионизированной воды, 10 мкл полученного раствора смешать с 990 мкл деионизированной воды.
Срок хранения в морозильной камере при температуре минус 20 °C - не более 6 мес.
Приготовление лизирующего буфера (2%-ного "СТАВ")
Растворить 0,5 г гексадецилтриметиламмония бромида в 10 мл деионизированной воды (при плохом растворении подогреть на водяной бане), добавить 2,5 мл 1М Трис - HCl, 7 мл 5М NaCl, 1 мл 0,5М ЭДТА, доводят объем раствора деионизированной водой до 25 мл, перемешивают. Срок хранения при температуре от 4 до 5 °C - не более 6 мес., допустимо образование осадка.
Перед использованием раствор выдерживают при комнатной температуре или подогревают в термостате при температуре 65 °C до полного растворения осадка.
Непосредственно перед использованием в приготовленный лизирующий буфер вносят меркаптоэтанол из расчета 4 куб. мм на 1 куб. см лизирующего буфера и перемешивают.
При проведении электрофореза использовать один из нижеперечисленных буферов.
Приготовление 1x ТВЕ буфера для электрофореза
В мерной колбе на 1000 мл растворить 10,8 г Трис (оксиметил) аминометана, 5,5 г борной кислоты и 0,92 г этилендиаминтетрауксусной

САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ОБОСНОВАНИЯ СРОКОВ ГОДНОСТИ И УСЛОВИЙ ХРАНЕНИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.1847-04 (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 06.03.2004)  »
Постановления и Указы »
Читайте также