РУКОВОДСТВО ПО МЕТОДАМ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА И БЕЗОПАСНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК К ПИЩЕ. РУКОВОДСТВО. Р 4.1.1672-03 (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 30.06.2003)


Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
30 июня 2003 года
Дата введения -
30 июня 2003 года
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
РУКОВОДСТВО
ПО МЕТОДАМ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА И БЕЗОПАСНОСТИ
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК К ПИЩЕ
РУКОВОДСТВО
Р 4.1.1672-03
1. Разработано: ГУ НИИ питания РАМН (руководитель В.А. Тутельян, ответственный исполнитель К.И. Эллер, Ю.П. Алешко-Ожевский, Т.В. Аристархова, В.Г. Байков, Н.А. Бекетова, В.В. Бессонов, С.В. Волкович, Л.Ш. Воробьева, О.А. Вржезинская, М.М.Г. Гаппаров, Н.А. Голубкина, Г.Ф. Жукова, М.Г. Киселева, Т.В. Киселева, В.М. Коденцова, С.Н. Кулакова, Л.Г. Левин, Ф.А. Медведев, Г.В. Никольская, В.В. Пименова, И.М. Скурихин, О.И. Соловьева, В.Б. Спиричев, Л.А. Харитончик, С.А. Хотимченко); Департаментом госсанэпиднадзора Минздрава России (А.И. Петухов); Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России (И.В. Брагина); Фармакопейным комитетом Минздрава России (В.Л. Багирова, Е.Л. Ковалева); ВИЛАР РАСХН (С.А. Пинеев).
2. Утверждено и введено в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г. Онищенко 30 июня 2003 г.
3. Вводится впервые.
Область применения
Настоящее Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище (далее - Руководство) разработано в соответствии с Федеральными законами "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" от 30.03.99 N 52-ФЗ (Собрание законодательства Российской Федерации, 1999, N 14, ст. 1650), "О качестве и безопасности пищевых продуктов" от 02.01.00 N 29-ФЗ (Собрание законодательства Российской Федерации, 2000, N 2, ст. 150), Постановлением Правительства Российской Федерации от 21.12.00 N 987 "О государственном надзоре и контроле в области обеспечения качества и безопасности пищевых продуктов".
Руководство устанавливает методы контроля ингредиентного состава и показателей качества и безопасности биологически активных добавок к пище (далее - БАД).
Руководство предназначено для юридических лиц и индивидуальных предпринимателей, осуществляющих деятельность в сфере производства и оборота БАД, а также для организаций и учреждений государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации (далее - госсанэпидслужбы России), осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор и контроль за безопасностью и эффективностью БАД в соответствии с СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов" и другими нормативными документами.
Методы контроля, изложенные в Руководстве, применяются на этапах экспертизы и регистрации БАД, при разработке и производстве БАД, их ввозе, хранении, транспортировке и реализации на территории Российской Федерации, при разработке нормативной и технической документации, регламентирующей вопросы обращения БАД.
Глава 1. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАКРОНУТРИЕНТОВ
I. Методы определения азотистых соединений
1. Метод определения общего белка
Метод заключается в определении азота по Кьельдалю с последующим пересчетом на белок. Сущность метода состоит в разложении органического вещества пробы кипящей концентрированной серной кислотой с образованием солей аммония, переведении аммония в аммиак, отгонке его в раствор кислоты, количественном учете аммиака титрометрическим методом и расчете содержания азота в исследуемом материале.
Подготовка к испытанию
Среднюю пробу БАД готовят согласно прописи отбора проб по стандарту определения белка на соответствующий продукт, в случае отсутствия стандарта - по техническим условиям на БАД. Для пересчета содержания белка на сухое вещество (в случае необходимости определения данного показателя) определяют влажность исследуемого БАД или пищевого сырья.
Подготовка реактивов и растворов
Приготовление смешанных катализаторов
Катализатор 1. Смешивают 1 весовую часть сернокислой меди и 30 весовых частей сернокислого калия, тщательно растирают в ступке до получения мелкозернистого порошка.
Катализатор 2. Смешивают 10 весовых частей сернокислой меди, 100 весовых частей сернокислого калия и 2 весовые части селена. Тщательно растирают в ступке до получения мелкозернистого порошка.
При приготовлении катализаторов 1 и 2 допускается заменять сернокислый калий надсернокислым калием в том же количестве.
Катализатор 3. Перекись водорода, 30%-ный водный раствор.
Приготовление 4%-ного раствора борной кислоты
40 г борной кислоты растворяют в небольшом количестве теплой дистиллированной воды при нагревании и переносят в колбу вместимостью 1000 куб. см. После охлаждения доводят объем дистиллированной водой до 1000 куб. см.
Приготовление 0,05 моль/куб. дм (0,1 н) раствора серной кислоты
Используют стандарт-титр серной кислоты. Раствор готовят в соответствии с правилами, приложенными к комплекту.
Допускается приготовление 0,05 моль/куб. дм раствора серной кислоты из концентрированной серной кислоты в соответствии с ГОСТ 25791.1-83.
Приготовление смешанного индикатора
Растворяют 0,20 г метилового красного и 0,10 г бромкрезолового зеленого в 100 куб. см 96%-ного этилового спирта.
Проведение испытания
Приготовление минерализата
Из усредненной измельченной гомогенной пробы исследуемого БАД для анализа взвешивают на обеззоленном фильтре или в пробирке точную навеску, с погрешностью не более 0,1%. Содержание азота в анализируемой пробе должно быть не менее 10 мг. Навеску количественно переносят в колбу Кьельдаля.
Минерализацию осуществляют одним из двух способов.
Способ 1
Добавляют в колбу Кьельдаля 1,5 - 2 г смешанного катализатора 1 или 2. После прибавления катализатора осторожно приливают 10 - 15 куб. см концентрированной серной кислоты.
Способ 2
Добавляют в колбу Кьельдаля 7 - 10 куб. см 30%-ной перекиси водорода в качестве окислителя. После прекращения бурной реакции приливают такое же количество концентрированной серной кислоты.
Колбу покрывают стеклянной воронкой и устанавливают на нагреватель так, чтобы ее ось была наклонена под углом 30 - 45° к вертикали. Вначале коблу нагревают умеренно, чтобы предотвратить бурное пенообразование.
При нагревании навеску время от времени помешивают вращательными движениями колбы. После исчезновения пены нагревание усиливают, пока жидкость не будет доведена до постоянного кипения. При этом следят за тем, чтобы на стенках колбы не оставалось черных несгоревших частиц, смывая их легким встряхиванием содержимого колбы или прибавлением небольшого количества серной кислоты.
После того как жидкость обесцветится (допускается слегка зеленоватый оттенок), нагрев продолжают в течение 30 мин.
После охлаждения к содержимому колбы постепенно приливают, взбалтывая, около 70 куб. см дистиллированной воды, охлаждают и приступают к отгонке аммиака.
В бачок-парообразователь через воронку наливают дистиллированную воду (несколько больше половины общего объема бачка) и открывают кран на воронке и зажим на отводящей пар трубке в колбу Кьельдаля.
Нагревают воду в бачке на газовой горелке или электрической плитке. Присоединяют пустую колбу Кьельдаля к каплеуловителю холодильника и воронке для щелочи и после того, как вода в бачке закипит, закрывают кран воронки бачка-парообразователя. Включают холодильник, подставляют под него пустую коническую колбу и в течение 5 - 10 мин. "пропаривают" прибор.
После пропаривания открывают краны воронки бачка-парообразователя и воронки для щелочи и закрывают зажим на отводящей пар трубке в колбу Кьельдаля.
Под холодильник подставляют вместо пустой конической колбы коническую колбу с предварительно налитыми в нее из пипетки 20 куб. см 4%-ной борной кислоты и 5 капель смешанного индикатора или 25 куб. см 0,05 моль/куб. дм раствора серной кислоты. Колбу подставляют под холодильник так, чтобы его кончик был погружен в раствор кислоты на глубину не менее чем 1 см. Вместо пустой колбы Кьельдаля присоединяют колбу с сожженной навеской анализируемой пробы.
Закрывают кран воронки для щелочи, наливают в воронку 33% раствора щелочи и открывают понемногу кран воронки для щелочи при осторожном покачивании колбы Кьельдаля, приливают избыток щелочи, при этом цвет раствора должен резко измениться - от прозрачного до синего или бурого. Открывают зажим на отводящей пар трубке в колбу Кьельдаля и закрывают остальные краны, при этом пар будет проходить через жидкость в колбе Кьельдаля и увлекать аммиак. В холодильнике пар конденсируется. Раствор аммиака попадает в колбу с 0,1 н. раствором серной кислоты. При нормальном кипении объем раствора в приемной колбе через 20 - 30 мин. обычно составляет 150 - 180 куб. см. Конец отгонки можно установить с помощью красной лакмусовой бумажки. Для этого приемную колбу отставляют от аппарата, предварительно обмыв конец холодильника дистиллированной водой, и подставляют лакмусовую бумажку под стекающие капли дистиллята. Если лакмус не синеет, отгон аммиака закончен. Если лакмус синеет, приемную колбу снова подставляют под холодильник и продолжают отгонку. После окончания отгонки приемную колбу опускают и конец холодильника обмывают дистиллированной водой в приемную колбу. После этого открывают краны на воронке бачка-парообразователя и воронке для щелочи и закрывают зажим отводящей пар трубки в колбу Кьельдаля. Содержимое приемной колбы титруют 0,1 моль/куб. дм раствором гидроокиси натрия до перехода окраски в зеленую.
Необходимо параллельно с определением азота в исследуемой пробе проводить определение азота в реактивах ("холостой опыт") для внесения соответствующей поправки в результат анализа. Определение азота в реактивах следует повторять каждый раз после замены партии серной кислоты, катализатора или титрованных растворов. Допускается отгонка аммиака (особенно в случае применения больших колб для сжигания) без использования пара непосредственно нагревом колбы на электрическом нагревателе. Проведение отгонки аммиака и все последующие операции проводятся так же, как и с применением пара.
Способ 3
Определение содержания азота проводят на автоматическом анализаторе типа "Кьельдек", фирма Текатор, Швеция, в соответствии с инструкцией к прибору.
Обработка результатов
Массовую долю азота (X) в испытуемой пробе в процентах от ее массы при проведении отгонки аммиака в борную кислоту вычисляют по формуле:
(V - V ) x K x 0,0014 x 100
1 0
Х = ----------------------------,
М
где:
V - объем раствора серной кислоты, израсходованный на
1
титрование испытуемого раствора, куб. см;
V - объем раствора серной кислоты, израсходованный на
0
титрование в контрольном опыте, куб. см;
К - поправка к титру 0,05 ммоль/куб. дм раствора серной
кислоты, если он приготовлен не из стандарт-титра;
0,0014 - количество азота, эквивалентное 1 куб. см раствора
серной кислоты, г;
М - масса навески, г.
Массовую долю азота (X) в испытуемой пробе в процентах от ее
массы при отгонке аммиака в серную кислоту вычисляют по формуле:
(V - V ) x K x 0,0014 x 100
1 0
X = ----------------------------,
M
где:
V - объем 0,1 моль/куб. дм раствора гидроокиси натрия,
0
израсходованный на титрование 0,05 моль/куб. дм серной кислоты в
контрольном опыте, куб. см;
V - объем 0,1 моль/куб. дм раствора гидроокиси натрия,
1
израсходованный на титрование серной кислоты в испытуемом
растворе, куб. см;
K - поправка к титру 0,1 моль/куб. дм раствора гидроокиси
натрия;
0,0014 - количество азота, эквивалентное 1 куб. см 0,05
моль/куб. дм раствора серной кислоты;
M - масса навески, г.
За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных испытаний. Результаты вычисляют до третьего десятичного знака и округляют до второго десятичного знака.
Расчет содержания общего азота в пробе при использовании автоматического анализатора (способ 3) проводят в соответствии с инструкцией к прибору.
Метрологические характеристики
Допустимое расхождение между двумя параллельными определениями (r) не должно превышать значений, вычисляемых по формуле:
r = 0,03 + 0,02 x Х ,
1
но не более 0,1% абсолютного содержания общего азота, где X -
1
среднее арифметическое результатов двух параллельных определений,
%.
Допустимое расхождение между результатами испытаний,
выполненных в двух разных лабораториях (R), не должно превышать
значений, вычисляемых по формуле:
R = 0,04 + 0,045 x Х ,
2
но не более 0,2% абсолютного содержания общего азота, где Х -
2
среднее арифметическое результатов двух испытаний, выполненных в
двух разных лабораториях, %.
Массовую долю азота в пересчете на сухое вещество продукта
(Х ) в процентах вычисляют по формуле:
3
X x 100
1
X = --------,
3 100 - W
где:
X - массовая доля азота в испытуемой пробе, %;
1
W - влажность испытуемой пробы, %.
Массовую долю белка (Y) в процентах вычисляют по формуле:
Y = K x X , X или X ,
1 2 3
где К - коэффициент пересчета азота на белок БАД:
с высоким (более 15%) содержанием липидов - 6,25;
с умеренным (2 - 15%) содержанием липидов - 6,38;
с низким содержанием липидов - 5,70.
2. Определение аминокислотного состава
Сущность метода заключается в гидролизе образца до аминокислот и последующем количественном определении образовавшихся аминокислот на аминокислотном анализаторе.
Подготовка к испытанию
В пробе определяют общий белок, содержание липидов и влажность по методикам, описанным в настоящем Руководстве.
Для жидких БАД учитывают содержащуюся воду в процессе приготовления гидролизующей смеси таким образом, чтобы концентрация соляной кислоты была 6 М. При содержании липидов более 5% проводят обезжиривание способом, указанным в табл. 1. После обезжиривания остаток подсушивают на воздухе и определяют содержание общего белка. Рассчитывают величину навески образца для гидролиза исходя из соотношения белка к кислоте, представленных в табл. 1, и при условии содержания белка в пробе не менее 5 мг.
Таблица 1
УСЛОВИЯ ПОДГОТОВКИ ПРОБ К АНАЛИЗУ ДЛЯ БАД,
СОДЕРЖАЩИХ РАЗЛИЧНЫЕ УРОВНИ ЛИПИДОВ
-----T------------T------------------------------T---------------¬
¦N ¦ БАД с ¦ Способ удаления липидов ¦Весовое соотно-¦
¦раз-¦содержанием ¦ ¦шение белок : ¦
¦дела¦ липидов ¦ ¦соляная кислота¦
¦ ¦ ¦ ¦6 М ¦
+----+------------+------------------------------+---------------+
¦1 ¦низким, ¦не требуется ¦1:200 ¦
¦ ¦менее 2% ¦ ¦ ¦
+----+------------+------------------------------+---------------+
¦2 ¦высоким, ¦экстракция 10-кратным коли- ¦1:250 ¦
¦ ¦более 15% ¦чеством диэтилового эфира 3 - ¦ ¦
¦ ¦ ¦4 раза или смесью этанол - ¦ ¦
¦ ¦ ¦хлороформ (1:2) 10-кратным ¦ ¦
¦ ¦ ¦количеством 2 раза ¦ ¦
+----+------------+------------------------------+---------------+
¦3 ¦умеренным, ¦не требуется ¦1:1000 ¦
¦ ¦2 - 15% ¦ ¦ ¦
L----+------------+------------------------------+----------------
Проведение испытания
Три навески БАД или обезжиренного остатка, подготовленных к гидролизу в соответствии с разделом 1, взятых с точностью 0,0001 г, помещают в стеклянную ампулу с оттянутым концом, заливают расчетным количеством соляной кислоты (в случае жидких БАД берут расчетное количество концентрированной кислоты и доводят до концентрации 6 М).
Ампулы запаивают, устанавливают в строго вертикальном положении в металлический патрон или фарфоровый стакан с парафином и помещают в сушильный шкаф с заранее отрегулированной температурой 110 +/- 2 °С. Нагревание проводят непрерывно в течение 24, 48 и 72 ч. Затем ампулы охлаждают до комнатной температуры. Необходимость трех временных отрезков гидролиза объясняется различиями в скорости отщепления отдельных аминокислот. На основании результатов последующих анализов содержания аминокислот за каждое время гидролиза строят кривую и методом интерполяции или экстраполяции до нулевого времени находят максимальную величину.
Каждую ампулу вскрывают и сразу приступают к удалению соляной кислоты. Если в гидролизате образовался видимый осадок, его удаляют центрифугированием или фильтрованием с последующим доведением фильтрата в мерной колбе до 25 куб. см до точного объема. В случае конечного объема больше 5 куб. см и при использовании высокочувствительных приборов для удаления соляной кислоты берут аликвоту.
Удаление соляной кислоты проводят одним из следующих способов:
а) помещают ампулу или пробирку в вакуум-эксикатор над гранулированным гидратом окиси натрия (NaOH) на 12 - 18 ч;
б) на роторном испарителе при температуре не выше 60 °С. Для этого гидролизат количественно переносят в грушевидную колбу, ополаскивая ампулу дистиллированной водой.
Остаток переносят количественно в мерную колбу с помощью цитратного буфера, pH 2,2, или раствора соляной кислоты 0,02 М и доводят до метки. Полученный раствор гидролизата подвергают анализу на аминокислотном анализаторе в соответствии с инструкцией к прибору.
В случае, если анализ не может быть проведен немедленно, осадок освобождают от следов соляной кислоты путем добавления к нему дистиллированной воды и повторного испарения на роторном испарителе или в вакуумном эксикаторе. Операцию повторяют до полного исчезновения запаха соляной кислоты.
Хранят образец в морозильной камере или нижней камере холодильника при температуре не выше 5 °С, перед анализом разводят цитратным буфером до необходимой концентрации. Обнаруженный осадок отфильтровывают через плотный фильтр.
Метрологические характеристики
Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому значению (RR) для основных аминокислот при концентрациях, характерных для трех важнейших групп продуктов, приведены в табл. 2.
Таблица 2
ДОПУСТИМЫЕ ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЕ (Rr)
И МЕЖЛАБОРАТОРНЫЕ (RR) РАСХОЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
СОДЕРЖАНИЯ АМИНОКИСЛОТ В ОСНОВНЫХ ГРУППАХ БАД
--------------T----------------T---------------T-----------------¬
¦Аминокислота ¦ С высоким ¦ С умеренным ¦ С низким ¦
¦ ¦ содержанием ¦ содержанием ¦ содержанием ¦
¦ ¦ белка ¦ белка ¦ белка ¦
¦ +-------T--------+-------T-------+--------T--------+
¦ ¦ Rr, % ¦ RR, % ¦ Rr, % ¦ RR, % ¦ Rr, % ¦ RR, % ¦
+-------------+-------+--------+-------+-------+--------+--------+
¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦
+-------------+-------+--------+-------+-------+--------+--------+
¦Лизин ¦11 ¦25 ¦10 ¦25 ¦12 ¦30 ¦
+-------------+-------+--------+-------+-------+--------+--------+
¦Гистидин ¦19 ¦32 ¦19 ¦37 ¦20 ¦31 ¦
+-------------+-------+--------+-------+-------+--------+--------+
¦Аргинин ¦11 ¦29 ¦14 ¦26 ¦12 ¦32 ¦
+-------------+-------+--------+-------+-------+--------+--------+
¦Аспарагиновая¦11 ¦24 ¦8 ¦19 ¦10 ¦26 ¦
¦кислота ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------+-------+--------+-------+-------+--------+--------+
¦Треонин ¦12 ¦26 ¦12 ¦30 ¦10 ¦24 ¦
+-------------+-------+--------+-------+-------+--------+--------+
¦Серин ¦14 ¦28 ¦11 ¦32 ¦16 ¦32 ¦
+-------------+-------+--------+-------+-------+--------+--------+
¦Глутаминовая ¦9 ¦19 ¦8 ¦16 ¦10 ¦22 ¦
¦кислота ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------+-------+--------+-------+-------+--------+--------+
¦Пролин ¦20 ¦40 ¦17 ¦42 ¦22 ¦41 ¦
+-------------+-------+--------+-------+-------+--------+--------+
¦Глицин ¦13 ¦24 ¦13 ¦24 ¦15 ¦26 ¦
+-------------+-------+--------+-------+-------+--------+--------+
¦Аланин ¦12 ¦30 ¦13 ¦32 ¦21 ¦38 ¦
+-------------+-------+--------+-------+-------+--------+--------+
¦Цистин ¦20 ¦60 ¦17 ¦55 ¦15 ¦45 ¦
+-------------+-------+--------+-------+-------+--------+--------+
¦Валин ¦11 ¦28 ¦10 ¦28 ¦20 ¦39 ¦
+-------------+-------+--------+-------+-------+--------+--------+
¦Метионин ¦18 ¦50 ¦11 ¦35 ¦22 ¦50 ¦
+-------------+-------+--------+-------+-------+--------+--------+
¦Изолейцин ¦15 ¦39 ¦11 ¦40 ¦11 ¦50 ¦
+-------------+-------+--------+-------+-------+--------+--------+
¦Лейцин ¦11 ¦26 ¦13 ¦24 ¦14 ¦39 ¦
+-------------+-------+--------+-------+-------+--------+--------+
¦Тирозин ¦10 ¦27 ¦14 ¦32 ¦20 ¦45 ¦
+-------------+-------+--------+-------+-------+--------+--------+
¦Фенилаланин ¦17 ¦31 ¦11 ¦44 ¦11 ¦40 ¦
+-------------+-------+--------+-------+-------+--------+--------+
¦Оксипролин ¦12 ¦40 ¦14 ¦40 ¦10 ¦28 ¦
+-------------+-------+--------+-------+-------+--------+--------+
¦Триптофан ¦18 ¦60 ¦19 ¦60 ¦22 ¦65 ¦
L-------------+-------+--------+-------+-------+--------+---------
II. Методы определения липидов
1. Методы определения содержания жира
в БАД на растительной и жировой основе
1.1. Гравиметрический метод
Метод основан на извлечении сырого жира из БАД растворителем, последующем удалении растворителя, высушивании и взвешивании извлеченного жира.
Подготовка проб к испытанию
Перед началом определений продукт, отобранный из средней пробы по ГОСТ 26312.1-84, тщательно перемешивают, отбирают навеску массой 50 г и измельчают на мельнице.
Приготовление патрона из фильтровальной бумаги
Для приготовления патрона фильтровальную бумагу обезжиривают следующим образом. Листы фильтровальной бумаги свертывают в трубку и помещают в цилиндр с пришлифованной пробкой так, чтобы вся бумага поместилась в цилиндре. В цилиндр перед помещением бумаги наливают 100 - 200 куб. см диэтилового эфира или гексана. После того как растворитель поднимется по бумаге до его верхнего края, цилиндр открывают, бумагу вынимают и дают растворителю испариться, затем ножницами от верхнего края отрезают полоску шириной 4 - 5 см, а остальную часть бумаги используют для приготовления патронов. Вату обезжиривают также в цилиндре. Обезжиренную вату и бумагу хранят в закрытой посуде. Обезжиренный прямоугольный кусок бумаги навертывают на деревянную болванку. По мере навертывания свободный край бумаги подворачивают складками для образования донышка патрона. Бумагу и болванку берут таким образом, чтобы стенки патрона получились двойными, а его диаметр был на 0,5 см меньше диаметра экстрактора. На дно патрона кладут кусочек обезжиренной ваты.
Проведение испытания
В патрон из фильтровальной бумаги отвешивают 1 - 5 г испытуемой пробы, с погрешностью не более 0,01 г, сверху кладут кусочек обезжиренной ваты. Приготовленный таким образом патрон помещают в экстрактор аппарата Сокслета так, чтобы он не был выше верхнего изгиба трубки. Колбу аппарата Сокслета высушивают при температуре 105 +/- 5 °С в течение 2 ч и после охлаждения взвешивают. Колбу наполняют примерно на 2/3 объема гексаном или диэтиловым эфиром и присоединяют к экстрактору. Пускают воду в холодильник и колбу с растворителем нагревают на водяной или песочной бане. При этом растворитель, находящийся в колбе, испаряется и в виде паров проходит через широкую трубку экстрактора в холодильник, где охлаждается и в виде капель поступает в экстрактор с патроном. При заполнении экстрактора растворителем до верхнего изгиба сифонной трубки последний переливается в колбу, унося с собой жир. В течение 1 ч должно быть 7 - 9 сливов растворителя. Экстракцию ведут 2 ч. Затем патрон удаляют из экстрактора и отгоняют растворитель из колбы в экстрактор. После заполнения экстрактора до верхнего изгиба сифонной трубки чистый растворитель сливают из экстрактора, который затем вновь присоединяют к аппарату Сокслета, и отгоняют оставшийся в колбе растворитель. По окончании отгонки растворителя отсоединяют экстрактор, колбу выдерживают на бане до испарения растворителя. После испарения растворителя колбу помещают в сушильный шкаф и высушивают при температуре 105 +/- 5 °С в течение 60 мин., охлаждают в эксикаторе и взвешивают. Последующее взвешивание проводят после повторной сушки в течение 30 мин. Высушивание и взвешивание повторяют до тех пор, пока разность результатов двух последовательных взвешиваний будет не более 0,001 г. Одновременно определяют влажность.
Обработка результатов
Массовую долю сырого жира в процентах, в пересчете на сухое вещество, в испытуемой пробе (X) вычисляют по формуле:
(M - M ) х 100
2 1
X = ---------------,
M x (100 - W)
где:
M - масса пробы, г;
M - масса пустой колбы, г;
1
M - масса колбы с жиром, г;
2
W - массовая доля влаги в испытуемой пробе, %.
За окончательный результат определения принимают среднее
арифметическое результатов (X ) двух параллельных определений.
1
Вычисления проводят с точностью до 0,1%.
Метрологические характеристики
Допустимое расхождение двух параллельных определений (r) не
должно превышать значений, рассчитанных по формуле:
r = 0,02 + 0,02 x Х ,
1
но не более 0,4% абсолютного содержания жира, где X - среднее
1
арифметическое результатов двух параллельных определений, %.
Допустимое расхождение между результатами испытаний,
выполненных в двух разных лабораториях (R), не должно превышать
значений, рассчитанных по формуле:
R = 0,04 + 0,035 x Х ,
2
но не более 0,8% абсолютного содержания жира, где Х - среднее
2
арифметическое результатов анализов, выполненных в двух разных
лабораториях, %.
1.2. Определение содержания жира в БАД
на зерновой основе
Для определения массовой доли жира в БАД на зерновой основе используют три варианта метода:
а) экстракционный метод с предварительным гидролизом навески;
б) рефрактометрический;
в) бутирометрический.
А. Экстракционный метод с предварительным
гидролизом навески
Метод основан на извлечении жира из предварительно гидролизованной навески изделия растворителем и определении количества жира взвешиванием после удаления растворителя из определенного объема полученного раствора.
Проведение испытания
Навеску продукта в 1 - 5 г, взвешенную с погрешностью не более 0,05 г, помещают в плоскодонную колбу вместимостью 300 куб. см, приливают 100 куб. см 1,5% соляной кислоты (или 10 куб. см 5% серной кислоты), кипятят в колбе с обратным холодильником на кипящей бане 30 мин. Затем колбу охлаждают водой до комнатной температуры, приливают в колбу 50 куб. см хлороформа, плотно закрывают хорошо пригнанной пробкой, энергично взбалтывают в течение 15 мин., затем выливают содержимое в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 2 - 3 мин. при 3000 об./мин.
В пробирке образуются три слоя. Верхний водный слой отбирают пипеткой. Пипеткой, снабженной резиновой грушей, отбирают хлороформенный раствор жира и фильтруют его в сухую колбу через небольшой ватный тампон, вложенный в узкую часть воронки, причем кончик пипетки должен при этом касаться ваты.
Фильтрат 20 куб. см помещают в предварительно доведенную до постоянной массы и взвешенную на аналитических весах колбу вместимостью 100 куб. см.
Отбор и фильтрация должны производиться в течение 2 мин.
Хлороформ из колбы отгоняют на горячей водяной бане, пользуясь холодильником. Оставшийся в колбе жир сушат до постоянной массы (обычно 1 - 1,5 ч) при температуре 100 - 105 °С, охлаждают в эксикаторе в течение 20 мин. и взвешивают колбу на аналитических весах.
Допускается также следующий способ расслаивания.
После гидролиза в охлажденную колбу добавляют 5 куб. см раствора аммиака, 50 куб. см хлороформа, затем содержимое колбы взбалтывают в течение 15 мин. и оставляют на 1 ч для отстаивания. За это время полностью отделяется и четко виден нижний хлороформный слой.
Если расслаивания не произойдет, добавляют еще 2 - 3 куб. см аммиака, следя за тем, чтобы реакция по фенолфталеину оставалась кислой.
После расслаивания отбор, фильтрацию, отгон хлороформного слоя и высушивание жира ведут, как описано выше.
Примечания. 1. Отгон и фильтрацию растворителя проводят под вытяжкой.
2. При отсутствии хлороформа допускается применение дихлорэтана, который следует хранить в темных склянках.
Обработка результатов
Массовую долю жира (X) в процентах в пересчете на сухое вещество вычисляют по формуле:
(М - М ) х 100 x 50 100
1
Х = ------------------- x -------,
20 х М 100 - W
2
где:
М - масса колбы с высушенным жиром, г;
M - масса пустой колбы, г;
1
50 - объем хлороформа, взятого для растворения жира, куб. см;
М - масса навески исследуемого изделия, г;
2
20 - объем хлороформного раствора жира, взятого для отгона,
куб. см;
W - массовая доля влаги в испытуемом изделии, %.
За окончательный результат испытания принимают среднее
арифметическое (X ) результатов двух параллельных определений.
1
Вычисления проводят с точностью до 0,1%.
Метрологические характеристики
Допустимое расхождение двух параллельных определений (r) не
должно превышать значений, рассчитанных по формуле:
r = 0,02 + 0,02 x Х ,
1
но не более 0,4% абсолютного содержания жира, где X - среднее
1
арифметическое результатов двух параллельных определений, %.
Допустимое расхождение между результатами испытаний,
выполненных в двух разных лабораториях (R), не должно превышать
значений, рассчитанных по формуле:
R = 0,04 + 0,035 x Х ,
2
но не более 0,8% абсолютного содержания жира, где X - среднее
2
арифметическое результатов анализов, выполненных в двух разных
лабораториях, %.
Б. Рефрактометрический метод
Метод основан на извлечении жира из навески образца альфа"-бромнафталином или альфа"-хлорнафталином. Массовую долю жира в образце определяют по разности коэффициентов преломления растворителя и раствора жира в растворителе.
Подготовка к испытанию
Определение коэффициента преломления растворителей. Определяют коэффициент преломления альфа"-бромнафталина или альфа"-хлорнафталина при температуре 20 °С, нанося 1 - 2 капли этих растворителей на призму рефрактометра.
Определение плотности растворителей
Плотность растворителей (ро, г/куб. см, при 20 °С) определяют пикнометром и вычисляют по формуле:
M
ро = -,
Q
где:
Q - водное число пикнометра, г;
М - масса растворителя, г.
Взвешивание проводят с погрешностью не более 0,0002 г. Расхождение между параллельными взвешиваниями должно быть не более 0,0005 г.
Калибровка пипеток. Микропипетки калибруют по растворителю, отмеривая ими соответствующий объем растворителя и взвешивая его в стаканчике с погрешностью не более 0,0002 г. Расхождение между параллельными взвешиваниями должно быть не более 0,0005 г.
Из трех взвешиваний берут среднее арифметическое и вычисляют объем пипетки (V) в куб. см по формуле:
М
V = --,
ро
где:
М - масса растворителя, соответствующая объему взятой пипетки, г;
ро - плотность растворителя при температуре 20 °С.
Проведение испытания
При анализе взвешивают 2 г БАД с точностью до 0,05 г и помещают в фарфоровую ступку. Затем калиброванной пипеткой приливают 4 куб. см растворителя. Содержимое ступки энергично растирают в течение 3 мин. Смесь переносят из ступки на маленький складчатый фильтр. Первые 2 - 3 капли фильтрата отбрасывают, а последующий фильтрат в количестве 2 - 3 капель помещают на призму рефрактометра и определяют коэффициент преломления.
При анализе изделий с низкой влажностью перед добавлением песка измельченную навеску смачивают 1 куб. см воды. Охладив массу, приливают точно 4 - 6 куб. см растворителя и вновь все растирают в течение 3 мин., затем добавляют 2 г безводного углекислого натрия, перемешивают, смесь из ступки переносят на складчатый фильтр и фильтруют в стаканчик.
Из полученного фильтрата наносят 2 - 3 капли на призму рефрактометра и определяют коэффициент преломления.
Определение коэффициента преломления проводят при 20 +/- 0,2 °С или любой комнатной температуре.
В последнем случае показатель преломления раствора приводят к температуре 20 °С путем внесения поправки по табл. 3.
Таблица 3
ТЕМПЕРАТУРНЫЕ ПОПРАВКИ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ПОКАЗАТЕЛЕЙ
ПРЕЛОМЛЕНИЯ РАСТВОРА ЖИРА В альфа"-БРОМНАФТАЛИНЕ
------T------T-----T------T-----T------T-----T------T-----T------¬
¦Т, °С¦По- ¦Т, °С¦По- ¦Т, °С¦По- ¦Т, °С¦По- ¦Т, °С¦По- ¦
¦ ¦правка¦ ¦правка¦ ¦правка¦ ¦правка¦ ¦правка¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9 ¦ 10 ¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦ отнять от показателя преломления ¦
+-----T------T-----T------T-----T------T-----T------T-----T------+
¦15,0 ¦0,0022¦16,0 ¦0,0018¦17,0 ¦0,0013¦18,0 ¦0,0009¦19,0 ¦0,0004¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦15,1 ¦0,0022¦16,1 ¦0,0017¦17,1 ¦0,0013¦18,1 ¦0,0008¦19,1 ¦0,0004¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦15,2 ¦0,0021¦16,2 ¦0,0017¦17,2 ¦0,0012¦18,2 ¦0,0008¦19,2 ¦0,0004¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦15,3 ¦0,0021¦16,3 ¦0,0016¦17,3 ¦0,0012¦18,3 ¦0,0007¦19,3 ¦0,0003¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦15,4 ¦0,0020¦16,4 ¦0,0016¦17,4 ¦0,0011¦18,4 ¦0,0007¦19,4 ¦0,0003¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦15,5 ¦0,0020¦16,5 ¦0,0016¦17,5 ¦0,0011¦18,5 ¦0,0007¦19,5 ¦0,0002¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦15,6 ¦0,0019¦16,6 ¦0,0015¦17,6 ¦0,0011¦18,6 ¦0,0006¦19,6 ¦0,0002¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦15,7 ¦0,0019¦16,7 ¦0,0015¦17,7 ¦0,0010¦18,7 ¦0,0006¦19,7 ¦0,0001¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦15,8 ¦0,0018¦16,8 ¦0,0014¦17,8 ¦0,0010¦18,8 ¦0,0005¦19,8 ¦0,0001¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦15,9 ¦0,0018¦16,9 ¦0,0014¦17,9 ¦0,0009¦18,9 ¦0,0005¦19,9 ¦0,0000¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦ прибавить к показателю преломления ¦
+-----T------T-----T------T-----T------T-----T------T-----T------+
¦20,0 ¦0,0000¦22,0 ¦0,0009¦24,0 ¦0,0018¦26,0 ¦0,0026¦28,0 ¦0,0035¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦20,1 ¦0,0000¦22,1 ¦0,0009¦24,1 ¦0,0018¦26,1 ¦0,0027¦28,1 ¦0,0036¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦20,2 ¦0,0001¦22,2 ¦0,0010¦24,2 ¦0,0018¦26,2 ¦0,0027¦28,2 ¦0,0036¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦20,3 ¦0,0001¦22,3 ¦0,0010¦24,3 ¦0,0019¦26,3 ¦0,0028¦28,3 ¦0,0037¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦20,4 ¦0,0002¦22,4 ¦0,0011¦24,4 ¦0,0019¦26,4 ¦0,0028¦28,4 ¦0,0037¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦20,5 ¦0,0002¦22,5 ¦0,0011¦24,5 ¦0,0020¦26,5 ¦0,0029¦28,5 ¦0,0037¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦20,6 ¦0,0003¦22,6 ¦0,0011¦24,6 ¦0,0020¦26,6 ¦0,0029¦28,6 ¦0,0038¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦20,7 ¦0,0003¦22,7 ¦0,0012¦24,7 ¦0,0021¦26,7 ¦0,0029¦28,7 ¦0,0038¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦20,8 ¦0,0004¦22,8 ¦0,0012¦24,8 ¦0,0021¦26,8 ¦0,0030¦28,8 ¦0,0039¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦20,9 ¦0,0004¦22,9 ¦0,0013¦24,9 ¦0,0022¦26,9 ¦0,0030¦28,9 ¦0,0039¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦21,0 ¦0,0004¦23,0 ¦0,0013¦25,0 ¦0,0022¦27,0 ¦0,0031¦29,0 ¦0,0040¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦21,1 ¦0,0004¦23,1 ¦0,0014¦25,1 ¦0,0022¦27,1 ¦0,0031¦29,1 ¦0,0040¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦21,2 ¦0,0005¦23,2 ¦0,0014¦25,2 ¦0,0023¦27,2 ¦0,0032¦29,2 ¦0,0040¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦21,3 ¦0,0006¦23,3 ¦0,0015¦25,3 ¦0,0023¦27,3 ¦0,0032¦29,3 ¦0,0041¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦21,4 ¦0,0006¦23,4 ¦0,0015¦25,4 ¦0,0024¦27,4 ¦0,0033¦29,4 ¦0,0041¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦21,5 ¦0,0007¦23,5 ¦0,0015¦25,5 ¦0,0024¦27,5 ¦0,0033¦29,5 ¦0,0042¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦21,6 ¦0,0007¦23,6 ¦0,0016¦25,6 ¦0,0025¦27,6 ¦0,0033¦29,6 ¦0,0042¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦21,7 ¦0,0007¦23,7 ¦0,0016¦25,7 ¦0,0025¦27,7 ¦0,0034¦29,7 ¦0,0043¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦21,8 ¦0,0008¦23,8 ¦0,0017¦25,8 ¦0,0026¦27,8 ¦0,0034¦29,8 ¦0,0043¦
+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+
¦21,9 ¦0,0008¦23,9 ¦0,0017¦25,9 ¦0,0026¦27,9 ¦0,0035¦29,9 ¦0,0044¦
L-----+------+-----+------+-----+------+-----+------+-----+-------
Отсчет показателя преломления раствора жира можно также производить при любой комнатной температуре без учета поправки на температуру при условии одновременного определения показателя преломления растворителя при той же температуре.
Обработка результатов
Массовую долю жира (X) в процентах в пересчете на сухое вещество вычисляют по формуле:
V x ж П - П 100
р р рж
X = ------ x -------- x 100 x -------,
M П - П 100 - W
рж ж
где:
V - объем растворителя, взятого для извлечения жира, куб. см;
p
ж - относительная плотность жира при 20 °С;
П - коэффициент преломления растворителя;
р
П - коэффициент преломления раствора жира в растворителе;
рж
П - коэффициент преломления жира;
ж
М - масса изделия, г;
W - влажность изделия, %.
За окончательный результат испытания принимают среднее
арифметическое (X ) двух параллельных определений.
1
Метрологические характеристики
Допустимое расхождение двух параллельных определений (r) не
должно превышать значений, рассчитанных по формуле:
r = 0,03 + 0,035 x Х ,
1
но не более 0,6% абсолютного содержания жира, где X - среднее
1
арифметическое результатов двух параллельных определений, %.
Допустимое расхождение между результатами испытаний,
выполненных в двух разных лабораториях (R), не должно превышать
значений, рассчитанных по формуле:
R = 0,04 + 0,06 x Х ,
2
но не более 1,2% абсолютного содержания жира, где X - среднее
2
арифметическое результатов анализов, выполненных в двух разных
лабораториях, %.
При вычислении процентного содержания жира пользуются показателями преломления и плотности жиров, указанными в табл. 4
Таблица 4
КОЭФФИЦИЕНТЫ ПРЕЛОМЛЕНИЯ ЖИРОВ
----------------------T---------------------------T--------------¬
¦ Наименование жира ¦ Коэффициент преломления ¦ Плотность ¦
+---------------------+---------------------------+--------------+
¦Кунжутное масло ¦ 1,4730 ¦ 0,919 ¦
+---------------------+---------------------------+--------------+
¦Подсолнечное масло ¦ 1,4748 ¦ 0,919 ¦
+---------------------+---------------------------+--------------+
¦Коровье масло ¦ 1,4605 ¦ 0,920 ¦
+---------------------+---------------------------+--------------+
¦Маргарин ¦ 1,4690 ¦ 0,928 ¦
+---------------------+---------------------------+--------------+
¦Арахисовое масло ¦ 1,4696 ¦ 0,917 ¦
+---------------------+---------------------------+--------------+
¦Горчичное масло ¦ 1,4720 ¦ 0,918 ¦
L---------------------+---------------------------+---------------
Примечания. 1. Если в исследуемом образце находится неизвестный жир или имеется смесь жиров, поступают следующим образом: 1 - 5 г измельченного изделия заливают трехкратным количеством растворителя (хлороформа, тетрахлоруглерода и др.), взбалтывают в течение 15 мин., вытяжку фильтруют в колбочку, растворитель полностью отгоняют, остаток подсушивают и определяют коэффициент преломления смеси жиров или неизвестного жира.
2. Для смеси жиров или неизвестного жира плотность принимается равной 0,920.
3. При хорошем растирании навески с растворителем в ступке, когда смесь перенесена на фильтр, разрешается стекающие из воронки капли раствора жира и растворитель наносить на призму рефрактометра, не дожидаясь, пока профильтруется вся смесь.
4. Вся работа с органическими растворителями проводится в вытяжном шкафу или хорошо вентилируемой камере.
В. Бутирометрический метод
Метод основан на растворении исследуемой навески в 60%-ной серной кислоте и отделении слоя жира в молочном бутирометре центрифугированием в присутствии изоамилового спирта, который образует с серной кислотой изоамилово-серный эфир, уменьшающий величину поверхностного натяжения жировых шариков и способствующий слипанию их в единый жировой слой.
Объем выделившегося жира измеряют в градуированной части бутирометра.
Проведение испытания
Из средней пробы готовых образцов отбирают по две навески массой по 2 г каждая. Навески помещают в фарфоровые стаканчики и заливают 9 куб. см 60%-ной серной кислоты.
Стаканчики погружают в водяную баню с температурой воды 80 °С и производят растворение навески в серной кислоте в течение 20 мин. при периодическом перемешивании стеклянной палочкой.
После растворения навески темную жидкость переносят в молочные бутирометры, смывая остатки из стаканчика с помощью 10 куб. см 60% серной кислоты.
В бутирометры осторожно (чтобы не замочить горлышко) приливают по 1 куб. см изоамилового спирта, плотно закрывают резиновыми пробками, плавно перемешивают в течение 3 мин. и помещают в гнезда водяной бани с температурой воды 80 °С на 5 мин. (пробками вниз).
По истечении 5 мин. бутирометры вынимают из водяной бани, размещают в молочной центрифуге (пробками к периферии) и центрифугируют 5 мин. После центрифугирования бутирометры снова помещают на 5 мин. в водяную баню с температурой воды 80 °С (пробками вниз), после чего вынимают и отмечают высоту желтого жирового слоя над темной жидкостью по числу малых делений градуированной части бутирометра.
Обработка результатов
Массовую долю жира (X) в процентах в пересчете на сухое вещество вычисляют по формуле:
N x 0,01133 x 100 x 100
X = -----------------------,
Q x (100 - W)
где:
N - высота жирового слоя в бутирометре по числу малых делений;
0,01133 - количество жира, соответствующее одному малому делению бутирометра, г;
W - влажность, %;
Q - навеска изделия, г.
Для удобства и ускорения расчета можно использовать данные табл. 5.
Таблица 5
ПОКАЗАНИЯ БУТИРОМЕТРА В ЗАВИСИМОСТИ
ОТ СОДЕРЖАНИЯ ЖИРА
--------T-------T-------T-------T-------T-------T-------T--------¬
¦Показа-¦Массо- ¦Показа-¦Массо- ¦Показа-¦Массо- ¦Показа-¦Массовая¦
¦ния бу-¦вая до-¦ния бу-¦вая до-¦ния бу-¦вая до-¦ния бу-¦ доля ¦
¦тиро- ¦ля жи- ¦тиро- ¦ля жи- ¦тиро- ¦ля жи- ¦тиро- ¦жира, % ¦
¦метра ¦ра, % ¦метра ¦ра, % ¦метра ¦ра, % ¦метра ¦ ¦
+-------+-------+-------+-------+-------+-------+-------+--------+
¦1 ¦0,57 ¦11 ¦6,23 ¦21 ¦11,90 ¦31 ¦17,56 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦2 ¦1,13 ¦12 ¦6,80 ¦22 ¦12,46 ¦32 ¦18,13 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦3 ¦1,70 ¦13 ¦7,36 ¦23 ¦13,03 ¦33 ¦18,69 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦4 ¦2,27 ¦14 ¦7,93 ¦24 ¦13,60 ¦34 ¦19,26 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦5 ¦2,83 ¦15 ¦8,50 ¦25 ¦14,16 ¦35 ¦19,82 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦6 ¦3,40 ¦16 ¦9,06 ¦26 ¦14,73 ¦36 ¦20,39 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦7 ¦3,96 ¦17 ¦9,63 ¦27 ¦15,29 ¦37 ¦20,96 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦8 ¦4,53 ¦18 ¦10,19 ¦28 ¦15,66 ¦38 ¦21,53 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦9 ¦5,10 ¦19 ¦10,76 ¦29 ¦16,42 ¦39 ¦22,09 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦10 ¦5,66 ¦20 ¦11,33 ¦30 ¦17,00 ¦40 ¦22,66 ¦
L-------+-------+-------+-------+-------+-------+-------+---------
Для дальнейшего пересчета на сухое вещество умножают массовую
долю жира в процентах, найденную по таблице, на 100 и делят на
разность (100 - W). За окончательный результат испытания принимают
среднее арифметическое (X ) результатов двух параллельных
1
определений.
Метрологические характеристики
Допустимое расхождение двух параллельных определений (r) не
должно превышать значений, рассчитанных по формуле:
r = 0,02 + 0,02 x Х ,
1
но не более 0,4% абсолютного содержания жира, где X - среднее
1
арифметическое результатов двух параллельных определений, %.
Допустимое расхождение между результатами испытаний,
выполненных в двух разных лабораториях (R), не должно превышать
значений, рассчитанных по формуле:
R = 0,04 + 0,04 x X ,
2
но не более 0,8% абсолютного содержания жира, где Х - среднее
2
арифметическое результатов анализов, выполненных в двух разных
лабораториях, %.
1.3. Определение массовой доли жира
в БАД с высоким содержанием жира методом экстракции
в аппарате Сокслета
Метод предназначен для определения массовой доли жира в БАД с высоким содержанием жира при проведении исследований и арбитражного анализа.
Диапазон измеряемых концентраций от 40 до 85%.
Метод основан на экстракции растворителем в аппарате Сокслета.
Подготовка к испытанию
Гигроскопическую вату и фильтровальную бумагу помещают в аппарат Сокслета и экстрагируют этиловым эфиром в течение 2 - 3 ч.
Подготовка экстракционных патронов
Патроны для экстракционных насадок типа НЭТ готовят, как указано выше.
Подготовка БАД к экстракции
В фарфоровую ступку взвешивают по разности 5 г БАД с записью значения массы до четвертого десятичного знака. Смешивают с 15 г прокаленного сульфата натрия и переносят в подготовленный экстракционный патрон, после чего ступку и шпатель с помощью пинцета протирают несколько раз ватой, сначала сухой, а затем смоченной этиловым эфиром. Всю вату помещают в тот же патрон. Сверху кладут небольшой слой ваты, затем края патрона завертывают.
Экстракция жира
Патрон с навеской БАД помещают в экстрактор. К экстрактору присоединяют чистую колбу, предварительно высушенную в течение 1 ч при 100 - 105 °С и взвешенную после охлаждения. Через холодильник при помощи воронки наливают в экстрактор этиловый эфир так, чтобы патрон в экстракторе был полностью покрыт слоем эфира. В колбу наливают также эфир на 1/3 ее объема.
Колбу собранного аппарата нагревают на закрытой водяной бане, обеспечивающей равномерное, не слишком сильное кипение эфира. Через 3 ч проверяют полноту экстракции. Для этого, охладив колбу, отсоединяют ее на мгновение от остальной части прибора и 1 - 2 капли эфира с нижнего конца сифона экстрактора наносят на чистое часовое стекло или кусочек фильтровальной бумаги. Экстракцию считают законченной, если после испарения эфира не остается масляных пятен на стекле или бумаге.
По окончании аппарат разбирают, вынимают патрон из экстрактора, последний присоединяют снова к колбе и отгоняют растворитель на водяной бане. Колбу сушат с жиром в сушильном шкафу в течение 1 ч при температуре 100 - 105 °С. Колбу взвешивают после охлаждения ее в эксикаторе. Последующие взвешивания производят через каждые 15 мин. сушки. Масса считается постоянной, если отличается от предыдущей не более чем на 0,0004 г.
Расчет результата определения
Массовую долю жира в БАД в % (X) вычисляют по формуле:
(M - M ) x 100
1 2
X = ---------------,
M
где:
M - масса колбы с высушенным жиром, г;
1
М - масса пустой колбы, г;
2
М - навеска БАД, г.
Конечным результатом считают среднее арифметическое двух
параллельных определений (X ) отдельных проб БАД. Вычисления
1
проводят до второго десятичного знака.
Метрологические характеристики
Допустимое расхождение двух параллельных определений (r) не
должно превышать значений, рассчитанных по формуле:
r = 0,02 + 0,01 x Х ,
1
но не более 0,4% абсолютного содержания жира, где X - среднее
1
арифметическое результатов двух параллельных определений, %.
Допустимое расхождение между результатами испытаний,
выполненных в двух разных лабораториях (R), не должно превышать
значений, рассчитанных по формуле:
R = 0,04 + 0,02 x Х ,
2
но не более 0,8% абсолютного содержания жира, где Х - среднее
2
арифметическое результатов анализов, выполненных в двух разных
лабораториях, %.
2. Методы определения жирнокислотного состава
Метод основан на разделении метиловых эфиров жирных кислот, полученных из липидов БАД, с помощью газожидкостной хроматографии.
Выделение липидов из БАД
Липиды выделяют экстракционным методом, предложенным для данной группы БАД, исключающим термическое воздействие на объект и изложенным в вышеприведенных разделах.
Получение метиловых эфиров жирных кислот
Метанолиз в щелочной среде нейтральных масел и жиров проводят по ГОСТ 30418-96 "Масла растительные. Метод определения жирнокислотного состава". Получение метиловых эфиров жирных кислот может быть проведено метанолизом в кислой среде или переэтерификацией липидов метанолом в среде хлористого водорода по ГОСТ Р 51486-99 "Масла растительные и жиры животные. Получение метиловых эфиров жирных кислот".
Для определения абсолютных количеств жирных кислот проводится анализ с применением внутреннего стандарта. В качестве внутреннего стандарта используют маргариновую кислоту или дибутилфталат.
Анализ метиловых эфиров жирных кислот
методом ГЖХ
Метод основан на использовании газожидкостной хроматографии (ГЖХ) метиловых эфиров жирных кислот по ГОСТ Р 51483-99 "Масла растительные и жиры животные. Определение методом газовой хроматографии массовой доли метиловых эфиров индивидуальных жирных кислот к их сумме". Результаты выражают в массовых долях каждого индивидуального компонента БАД.
Эталонный стандарт - смесь метиловых эфиров известного состава, желательно, аналогичного составу анализируемого вещества.
Идентификацию пиков метиловых эфиров жирных кислот проводят по относительным приведенным временам удерживания или эквивалентным длинам цепи (ЭДЦ).
В качестве неподвижных жидких фаз используют полиэфиры типа полиэтиленгликольадипат, полипропиленгликольадипат, диэтиленгликольсукцинат, цианосиликоны (SP-100, FFAP, силары OV-275, Sil-88) или другие жидкости, дающие необходимое хроматографическое разделение.
Комментарий к условиям анализа
Температура термостата колонок:
а) при анализе смесей метиловых эфиров жирных кислот с длиной цепи более 14 углеродных атомов 170 - 190 °С (изотермический режим). Условия подбирают таким образом, чтобы метилолеат выходил из колонки за 15 мин.;
б) при анализе смесей метиловых эфиров, содержащих низкомолекулярные компоненты, температуру термостата программируют в пределах от 120 до 195 °С со скоростью 6 - 8 °С в 1 мин. (при наличии метилового эфира масляной кислоты начальная температура программирования 70 °С).
Величина вводимой пробы - около 1 - 2 мкл раствора метиловых эфиров в гексане для набивных колонок и 0,2 - 0,3 мкл для капиллярных.
В случае необходимости рекомендуется производить анализ на двух зафиксированных фазах с различными полярностями с целью проверки отсутствия скрытых пиков (для рыбьего жира или в случае одновременного присутствия С18:3, С20:0, С20:1).
Обработка результатов
Качественный анализ
Анализируют эталонную смесь метиловых эфиров. Строят график зависимости логарифма времени удерживания от числа углеродных атомов в цепи. Получают ряд параллельных прямых для насыщенных, моно-, ди- и т.д. ненасыщенных метиловых эфиров кислот или находят величины эквивалентной длины цепи ЭДЦ для ненасыщенных и разветвленных жирных кислот по формуле:
lg V - lg V
x n
ЭДЦ = n + ---------------,
lg V - lg V
n+1 n
где:
n - число атомов углерода в насыщенной кислоте нормального
строения, находящейся на хроматограмме перед неизвестным
компонентом;
lg V - логарифм времени удерживания кислоты с n-числом атомов
n
углерода;
lg V - логарифм времени удерживания кислоты с (n+1)-числом
n+1
атомов углерода;
lg V - логарифм времени удерживания неизвестного компонента.
x
Идентифицируют пики на хроматограмме анализируемой смеси по полученному графику или по величинам ЭДЦ. Следует избегать условий анализа, при которых происходит наложение пиков метиловых эфиров различных кислот (например, метиллинолената и метиларахината).
Количественный анализ и способы расчета
За исключением специальных анализов расчет проводят методом внутренней нормализации, когда все компоненты смеси представлены на хроматограмме и площадь всех пиков компонентов составляет 100%. При наличии интегратора пользуются полученными с его помощью цифрами. При отсутствии интегратора площади пиков измеряют, умножая высоту пика на его ширину (или ширину пика на половине его высоты) и учитывая переключения чувствительности усилителя, используемые во время записи хроматограммы.
Расчет без использования поправочных коэффициентов
Расчет массовой доли i-го компонента в % проводят по формуле:
S
i
С = ------,
SUM S
i
где:
С - массовая доля i-го компонента;
S - площадь пика i-го компонента;
i
SUM S - сумма всех площадей пиков.
i
За результат анализа принимают среднее арифметическое (X ) из
1
двух параллельных измерений.
Расчет с использованием поправочных коэффициентов
В случае, когда в анализируемой смеси присутствуют кислоты с
12 и менее углеродными атомами в цепи, расчет ведется с
применением поправочных коэффициентов.
Поправочные коэффициенты (K ) рассчитывают по хроматограммам
i
эталонных смесей известного состава, полученным в условиях,
применяемых для анализа образца по формуле:
M x SUM S
i i
K = -----------,
i S x SUM M
i i
где:
M - масса i-го компонента в эталонной смеси, г;
i
SUM M - масса эталонной смеси, г.
i
Часто используют относительные поправочные коэффициенты (K")
i
по отношению к поправочному коэффициенту метилпальмитата (К ):
C16
R
i
K" = ----.
i K
C16
Массовую долю i-го компонента анализируемой смеси определяют
по формуле:
K x S
i i
C = ----------- x 100.
i SUM K x S
i i
За результат анализа принимают среднее арифметическое из двух параллельных измерений с записью до первого десятичного знака.
Расчет с применением внутреннего стандарта
В случаях, когда не все компоненты в анализируемой смеси элюируются из колонки или присутствуют очень летучие компоненты, используют для расчета метод внутреннего стандарта.
В качестве внутреннего стандарта применяют метиловые эфиры кислот, отсутствующие в анализируемой смеси. При анализе проб, содержащих масляную кислоту, в качестве внутреннего стандарта используют валериановую кислоту, в остальных случаях - пентадекановую или маргариновую кислоту. Массовую долю i-го компонента пробы определяют по формуле:
M x K x S
s i i
C = ------------ x 100 x m,
i M x K x S
s s
где:
m - содержание липидов в продукте, мг в 100 г;
M - масса внутреннего стандарта, мг;
s
М - масса образца, мг;
K - поправочный коэффициент внутреннего стандарта;
s
S - площадь пика внутреннего стандарта.
s
Метрологические характеристики
Допустимые расхождения содержания жирных кислот в продукте
рассчитывают (в %) по следующим формулам:
r = 0,225 + 0,04 x Х ,
1
но не более 1% абсолютного содержания кислоты;
R = 0,310 + 0,075 x Х ,
2
но не более 3% абсолютного содержания кислоты.
3. Методы определения

ПРИКАЗ Минэнерго РФ от 30.06.2003 n 264 ОБ УТВЕРЖДЕНИИ МЕТОДИЧЕСКИХ РЕКОМЕНДАЦИЙ ПО ОЦЕНКЕ ВЫБРОСОВ ЗАГРЯЗНЯЮЩИХ ВЕЩЕСТВ В АТМОСФЕРУ ОТ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ ПРОИЗВОДСТВ ТЕПЛОЭЛЕКТРОСТАНЦИЙ И КОТЕЛЬНЫХ  »
Постановления и Указы »
Читайте также