ПРОФИЛАКТИКА И ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА ЛЮДЕЙ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУ 3.1.7.1189-03 (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 30.01.2003)


Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
30 января 2003 года
Дата введения -
1 мая 2003 года
3.1.7. ПРОФИЛАКТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ.
ИНФЕКЦИИ, ОБЩИЕ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ
ПРОФИЛАКТИКА И ЛАБОРАТОРНАЯ
ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА ЛЮДЕЙ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУ 3.1.7.1189-03
1. Методические указания разработаны: Министерством здравоохранения Российской Федерации (Федоров Ю.М., Жилина Н.Я., Хадарцев О.С.), ГУ Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (Желудков М.М., Толмачева Т.А.), ГУ Противочумный центр Минздрава России (Горшенко В.В.).
2. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра Российской Федерации Г.Г. Онищенко 30 января 2003 г. Введены в действие 1 мая 2003 г.
3. Введены взамен "Методических указаний по профилактике и лабораторной диагностике бруцеллеза людей" (1980).
1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
1.1. Методические указания "Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза людей" разработаны в помощь специалистам санитарно-эпидемиологических, лечебно-профилактических и противочумных учреждений.
1.2. Настоящие Методические указания обязательны для выполнения на всей территории Российской Федерации санитарно-эпидемиологическими, лечебно-профилактическими и противочумными учреждениями.
2. ОБЩИЕ ДАННЫЕ
Эпидемиологическая обстановка по бруцеллезу в Российской Федерации остается неблагополучной и определяется наличием бруцеллеза среди сельскохозяйственных животных - мелкого и крупного рогатого скота, являющихся основными источниками возбудителя бруцеллеза для людей. На протяжении последнего десятилетия в стране ежегодно регистрируется от 400 до 700 больных с впервые диагностированным бруцеллезом. Больные регистрируются преимущественно на территориях с развитым овцеводством, что в значительной степени связано с более выраженным течением у людей заболевания бруцеллезом козье-овечьего вида. В среднем 47% больных выявляются в Северо-Кавказском районе, до 15% - в Поволжском районе.
В течение последнего десятилетия почти в 3 раза увеличился удельный вес детей в возрасте до 14 лет в общей заболеваемости "впервые диагностированного" бруцеллеза - с 5 до 15%, что является показателем напряженной эпидситуации по этой инфекции. Периодически регистрируются групповые заболевания людей с числом заболевших 10 и более.
Относительное снижение заболеваемости людей бруцеллезом за последние 10 лет нельзя признать достоверным, поскольку оно обусловлено в основном неудовлетворительными выявлением и диагностикой бруцеллеза, проходящего под другими диагнозами. В целом по стране в учреждениях здравоохранения в 2 раза снизилось число диагностических лабораторных исследований на бруцеллез, в 4 раза сократились бактериологические исследования материала от больных людей. Лабораториями отделов особо опасных инфекций типирование выделенных культур не проводится, что, наряду с недостаточным числом бактериологических исследований, препятствует эффективному проведению противоэпидемических мероприятий, осуществлению мониторинга за циркуляцией возбудителя на территории страны. Недостатки в лабораторной диагностике бруцеллеза не позволяют проводить необходимое этиотропное лечение больных бруцеллезом людей, что приводит к хроническому течению заболевания и к последующей инвалидности.
Ослабление контроля за проведением противобруцеллезных мероприятий на животноводческих объектах, несоблюдение руководителями животноводческих хозяйств и владельцами частного скота ветеринарно-санитарного законодательства способствует появлению и распространению скрытых очагов инфекции, о чем свидетельствует выявление больных людей на территориях, где не зарегистрированы больные бруцеллезом сельскохозяйственные животные.
Бруцеллез по-прежнему занимает первое место среди профессиональных заболеваний инфекционной и паразитарной этиологии. Однако ежегодно сокращается лабораторное обследование на бруцеллез при плановых профосмотрах контингентов, профессионально связанных с риском заражения бруцеллезом. Практически не проводятся профосмотры с лабораторным обследованием на бруцеллез работников коммерческих хозяйств и предприятий.
Сложившееся положение является следствием ослабления внимания руководителей учреждений госсанэпиднадзора и здравоохранения к проблеме бруцеллеза; недостаточной координации деятельности учреждений санитарного и ветеринарного надзора в организации и проведении противобруцеллезных мероприятий; сокращения лабораторных, в т.ч. бактериологических, диагностических исследований материала от людей; неудовлетворительного выявления и регистрации профессиональных заболеваний, ослабления контроля за организацией и проведением профосмотров на бруцеллез контингентов, профессионально связанных с риском заражения бруцеллезом; отсутствия зарегистрированных иммунобиологических препаратов для лабораторной диагностики бруцеллеза у людей; недостаточного уровня подготовки специалистов лечебно-профилактических учреждений по вопросам профилактики, лабораторной диагностики, клиники и лечения бруцеллеза.
Настоящие Методические указания отражают современные подходы к эпидемиологическому надзору за бруцеллезной инфекцией, профилактике и лабораторной диагностике бруцеллеза.
3. ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЙ НАДЗОР ЗА БРУЦЕЛЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ
Бруцеллез - острое инфекционно-аллергическое, зоонозное заболевание с высокой потенциальной возможностью перехода в хроническую форму. Возбудитель бруцеллеза относится ко II группе патогенности, пути и факторы передачи инфекции разнообразны, человек в любом возрасте высоковосприимчив к бруцеллезу, заболевание длительное, трудно поддающееся лечению, поражает практически все органы и системы организма и, как правило, сопровождается хронизацией инфекционного процесса с нередкой последующей инвалидностью больного.
3.1. Общие сведения о возбудителе заболевания
Возбудителем бруцеллеза являются микроорганизмы, относящиеся к роду Brucella. По международной классификации род Brucella состоит из шести самостоятельных видов, которые подразделяются на ряд биоваров. Так, В.melitensis состоит из 3 биоваров, носителями которых являются козы и овцы. В.abortus представлен 7 биоварами, основной хозяин возбудителя - крупный рогатый скот. В.suis состоит из 5 биоваров, основной хозяин - свиньи, однако носителем 2-го биовара являются также зайцы, 4-го биовара - олени, а 5-го - мышевидные грызуны. В.neotomae была обнаружена у пустынных кустарниковых крыс. В.ovis выделяется от овец, а В.canis - от собак. На территории России циркулируют В.melitensis, В.abortus, В.suis, В.ovis, а с 1994 г. регистрируются случаи выделения от собак бруцеллы вида canis.
Определение видов и биоваров бруцелл на конкретных территориях и в очагах инфекции имеет важное эпидемиологическое и эпизоотологическое значение с точки зрения классификации очагов, оценки степени напряженности эпидемического и эпизоотического процессов, установления фактов миграции бруцелл с одного вида животных на другой (особенно опасна миграция В.melitensis на крупный рогатый скот), выявления путей распространения возбудителя, выбора тактики лечения и др.
Бруцеллы относятся к патогенным микроорганизмам. Разные виды бруцелл и даже разные штаммы одного и того же вида отличаются неодинаковой вирулентностью. Наиболее патогенны для человека бруцеллы вида melitensis, которые нередко вызывают эпидемические вспышки заболевания. В.abortus и В.suis вызывают, как правило, спорадические, клинически выраженные случаи заболевания. Что касается В.ovis, В.neotomae и В.canis, то известны случаи заболевания людей, заразившихся от собак бруцеллами вида canis, однако эпидемиологическая значимость этих видов бруцелл до конца не изучена.
Бруцеллы всех шести видов практически неотличимы друг от друга по морфологическим признакам. Бруцеллы - микроорганизмы шаровидной, овоидной или палочковидной формы. Размеры бруцелл в среднем равны 0,3 - 0,6 мкм для кокковых форм и 0,6 - 2,5 мкм для палочковидных. Спор не образуют, жгутиков не имеют, неподвижны. Красятся анилиновыми красками. При определенных условиях (воздействие специфическим бактериофагом, выращивание на средах с добавлением 10% иммунной сыворотки и т.п.) образуют капсулу; грамотрицательны; характеризуются замедленным ростом на питательных средах; некоторые штаммы требуют для роста добавления 5 - 10% CO2, особенно при первоначальном выделении. Оптимальная температура для роста бруцелл 37 °C, оптимальная pH - 6,8 - 7,2. Бруцеллы подвержены изменчивости и могут переходить из S-формы в R- и L-формы.
Бруцеллы обладают высокой инвазивностью и могут проникать через неповрежденные слизистые покровы, относятся к внутриклеточным паразитам, но могут также находиться вне клетки.
Бруцеллы малоустойчивы к высокой температуре. В жидкой среде при +60 °C они погибают через 30 мин., при +80 - 85 °C - через 5 мин., при кипячении моментально. Обладают большой устойчивостью к воздействиям низких температур, длительно сохраняются в пищевых продуктах, в т.ч. хранящихся в холодильниках и морозильных камерах. Под действием прямых солнечных лучей бруцеллы гибнут через 4 - 5 часов, в почве сохраняют жизнеспособность до 100 дней, в воде - до 114 дней.
Возбудитель бруцеллеза весьма чувствителен к различным дезинфицирующим веществам: 2%-ный раствор фенола, 3%-ный раствор креолина и лизола, 0,2 - 1%-ный раствор хлорной извести и хлорамина убивают их в течение нескольких минут.
3.2. Эпизоотология бруцеллеза
Бруцеллезом болеют в основном сельскохозяйственные животные - овцы, козы, крупный рогатый скот, свиньи, верблюды, северные олени и др. Причем каждый вид животных обычно поражается определенным видом возбудителя. Однако бруцеллы вида melitensis и abortus могут мигрировать на других животных. Это имеет большое эпидемиологическое значение, особенно в случае миграции наиболее опасного для человека вида melitensis на крупный рогатый скот.
Микроб проникает в организм животного через слизистые оболочки пищеварительного тракта, половых и дыхательных путей, конъюнктиву, а также через кожные покровы в случае нарушения их целостности.
Клиническое течение бруцеллеза у животных характеризуется полиморфизмом, основным признаком является аборт. Аборты имеют решающее значение в эпизоотологии и эпидемиологии бруцеллеза, т.к. сопровождаются массивным и длительным выделением бруцелл с абортированным плодом, плацентой, выделениями из матки и влагалища, при метритах и других поражениях половых и родовых органов. Больные животные могут выделять бруцеллы с молоком и мочой. Таким образом, выделение большого количества бруцелл при абортах и родах больных животных, а также с молоком является основным фактором распространения инфекции в хозяйстве, а нередко и заражения людей.
Помимо абортов бруцеллез у животных может сопровождаться поражением суставов (артриты), синовиальной системы (тендовагиниты, бурситы), половой сферы (эндометриты, вагинит, у самцов - орхит, эпидидимит), молочных желез (мастит).
Бруцеллез у животных может протекать в скрытой форме и обнаруживаться лишь при специальном исследовании. Распространять возбудителя инфекции могут и животные, не имеющие клинических проявлений бруцеллеза, но положительно реагирующие при обследовании на бруцеллез. Отдельные животные остаются носителями бруцелл и выделяют их в течение 5 лет и более.
3.3. Эпидемиологические особенности бруцеллеза
Естественным резервуаром бруцелл в природе являются животные. В связи с этим эпидемиология бруцеллеза целиком определяется его эпизоотологией, а заболевание с полным правом можно отнести к типичным зоонозам.
Основными источниками возбудителя инфекции для людей при бруцеллезе являются овцы, козы, крупный рогатый скот и свиньи. Отмечаются случаи заражения людей от северных оленей. Иногда источником заражения могут быть лошади, верблюды, яки, собаки и другие животные. Имеют место случаи заражения людей от собак как В.melitensis, В.canis, так и другими видами бруцелл. Описаны случаи заражения людей от кошек (В.suis).
Особое значение в заболеваемости людей имеет неблагополучие по бруцеллезу овцеводческих хозяйств, в которых чаще возникают групповые заболевания. В очагах крупного рогатого скота и свиноводческих фермах обычно регистрируются единичные, спорадические случаи заболевания.
Роль человека в передаче бруцеллезной инфекции эпидемиологического значения не имеет.
Пути распространения бруцеллеза многообразны, т.к. бруцеллы выделяются больными животными через все выделительные системы. Передача возбудителя бруцеллеза и заражение людей происходит контактным, алиментарным и реже - аэрогенным путем, возможны сочетанные пути передачи.
Наибольшую роль в очагах бруцеллеза имеет контактный механизм передачи инфекции.
Заболеваемость, в большей степени, отмечается среди лиц, имеющих тесный контакт с больными животными (чабаны, пастухи, работники ферм, в т.ч. звероводческих, зооветспециалисты, доярки). Особенно высока возможность инфицирования при оказании животным помощи во время родов и при абортах, когда проводят ручное отделение плаценты. Заражение может произойти при переработке мясного сырья, кожи, шерсти, шкур животных, больных бруцеллезом (работники мясоперерабатывающей промышленности, кожзаводов, шерстеобрабатывающих предприятий). В таких случаях проникновение бруцелл в организм человека происходит через кожные покровы. Малые размеры возбудителя инфекции и его высокая инвазивная способность позволяют бруцеллам проникать через неповрежденную кожу. Различные повреждения кожных покровов (царапины, ушибы, мацерация) в значительной степени увеличивают эти возможности.
При контактном пути заражения проникновение бруцелл происходит также через слизистые глаз, носа, ротовой полости. Такой механизм проникновения бруцелл представляет особую опасность при несоблюдении или невозможности соблюдения мер личной профилактики работниками животноводства и предприятий по переработке продуктов животноводства и др., которые по своей небрежности заносят инфицированный материал на слизистые рта, носа и глаз.
Алиментарный путь передачи бруцелл возможен при употреблении пищевых продуктов, полученных от зараженных животных. Наибольшую опасность представляют сырое молоко и молочные продукты (брынза, сливки, сметана, кумыс и др.). Коровье молоко является причиной инфицирования многих людей (особенно в городах), которые профессионально не связаны с животноводством. Бруцеллы сохраняются в молоке до 10 дней, а в брынзе - до 45 дней. Опасность инфицирования людей бруцеллезом при алиментарном заражении в значительной степени зависит от вида бруцелл, находящихся в молоке или молочных продуктах.
Наибольшую опасность представляет бруцелла вида melitensis, если для приготовления молочной продукции использовалось зараженное овечье (козье) молоко или коровье (в случаях миграции В.melitensis на крупный рогатый скот), что может вызвать массовые заболевания людей бруцеллезом с тяжелым течением инфекционного процесса.
Мясо представляет значительно меньшую эпидемиологическую опасность, т.к. оно, как правило, употребляется в термически обработанном виде. Однако в ряде случаев при недостаточной термической обработке в связи с национальными особенностями приготовления пищи (строганина, шашлык с кровью, сырой фарш и др.) мясо и мясные продукты могут являться причиной заражения бруцеллезом. Бруцеллы сохраняются во внутренних органах, костях, мышцах и лимфатических узлах инфицированных туш более одного месяца, а в замороженных продуктах в течение всего срока хранения.
При заражении алиментарным путем решающую роль играет возможность проникновения бруцелл через слизистые оболочки ротовой полости и верхних отделов пищеварительного тракта, т.к. бруцеллы быстро погибают в кислой среде желудочного сока, не успев проникнуть во внутренние органы и ткани организма.
Аэрогенный путь заражения человека бруцеллезом возможен при стрижке шерсти, сборе пуха, уборке скотных дворов, обработке шкур, убое скота и других производственных процессах, связанных с уходом за больными животными, или при обработке продуктов и сырья, полученных от них. В таких случаях нередки сочетанные пути передачи возбудителя - аэрогенный и контактный, аэрогенный и алиментарный (при сглатывании накопившейся слизи в носоглотке). В шерсти бруцеллы сохраняют жизнеспособность при хранении при комнатной температуре в течение 3 месяцев. Аэрогенный путь передачи возможен и в бактериологических лабораториях, во время различных манипуляций при работе с чистыми культурами (пересевы, центрифугирование и др.), когда могут образовываться аэрозоли. Аэрогенный путь при передаче возбудителя бруцеллезной инфекции определяется возможностью проникновения частиц, диаметр которых менее 5 мкм, в нижние отделы дыхательных путей (бронхиолы и альвеолы).
Известны казуистические случаи заражения людей половым путем.
Сезонность в заболеваемости людей бруцеллезом обусловлена хозяйственной деятельностью человека и, в частности, процессом обслуживания сельскохозяйственных животных. Особого внимания заслуживает время отелов, окотов и абортов, уход за животными в послеродовый период, а также время купки и стрижки овец. Для заболевания людей бруцеллезом, вызванным козье-овечьим видом, характерна весенне-летняя сезонность. При заражении бруцеллезом от крупного рогатого скота сезонность выражена слабее, что объясняется длительным периодом лактации и заражением в основном через молоко и молочные продукты.
Различия в заболеваемости по полу зависят от занятости мужчин и женщин в животноводстве. В регионах, где основным источником заражения людей является мелкий рогатый скот, наибольший процент заболеваемости отмечается у мужчин. В очагах бруцеллеза крупного рогатого скота, где доля мужского труда имеет второстепенное значение, заболеваемость женщин несколько выше, чем мужчин.
В очагах бруцеллеза сельскохозяйственных животных часто отмечаются заболевания людей всех возрастных групп, от детей дошкольного возраста (в том числе грудных) до людей преклонного возраста. Однако большая часть людей, заболевших бруцеллезом, приходится на средний работоспособный возраст, так как именно эта группа людей больше других принимает участие в обслуживании животных и обработке сырья животного происхождения.
Заболеваемость людей бруцеллезом носит выраженный профессиональный характер. Заражаются люди преимущественно в результате непосредственного контакта с больными бруцеллезом животными или их сырьем. К группам профессионального риска относятся работники как государственных, так и других форм собственности животноводческих (звероводческих) хозяйств (ферм), мясо- и молококомбинатов и других предприятий по переработке продуктов и сырья животного происхождения, убойных пунктов, пунктов стрижки, купки овец, зооветработники, персонал лабораторий, работающих с вирулентными культурами, и персонал других предприятий, учреждений, работа которых связана с риском заражения бруцеллезом.
3.4. Эпидемиологический надзор за бруцеллезом
Эпидемиологический надзор за бруцеллезом - это комплексное наблюдение за инфекцией, включающее анализ многолетней динамики заболеваемости в разных возрастных группах и разных контингентах населения, клинических форм заболевания, состояния иммунологической структуры населения, а также видов бруцелл, циркулирующих на данной территории, анализ эпизоотологической ситуации по бруцеллезу за последние годы.
Организационно-методическое руководство по осуществлению эпидемиологического надзора за бруцеллезной инфекцией обеспечивается профильными структурными подразделениями (курирующими вопросы особо опасных инфекций) центров государственного санитарно-эпидемиологического надзора в субъектах Российской Федерации. Работа по вопросам бруцеллеза осуществляется во взаимодействии с лечебно-профилактическими учреждениями.
Эффективность профилактических и противоэпидемических противобруцеллезных мероприятий зависит от комплексности в работе государственной санитарно-эпидемиологической службы и государственной ветеринарной службы и от детального изучения эпизоотологических и эпидемиологических особенностей инфекции на конкретной территории.
Задачами эпидемиологического надзора являются:
- слежение за заболеваемостью людей бруцеллезом, ее территориальным распространением и заболеваемостью отдельных групп населения (сельского, городского, по возрастным и профессиональным группам);
- активное выявление лечебно-профилактическими учреждениями больных бруцеллезом из числа больных, с диагнозами, не исключающими заболевание бруцеллезом или сопоставимыми с этой инфекцией, лабораторное обследование на бруцеллез, в т.ч. на гемокультуру (по показаниям), длительно лихорадящих больных (более 5 дней);
- анализ эпизоотологической ситуации по бруцеллезу по материалам, представляемым государственной ветеринарной службой, включая анализ комплекса ветеринарно-санитарных мероприятий, направленных на ограничение рассеивания инфекции и предупреждение заражения здоровых животных;
- слежение за численностью контингентов, подвергающихся риску заражения на эндемичных по бруцеллезу территориях, а также за контингентами, профессионально связанными с риском заражения бруцеллезом;
- слежение за динамикой эпидемиологически значимых социальных явлений (миграция населения и сельскохозяйственных животных, характер хозяйственной деятельности, санитарно-гигиенические условия работы в сельскохозяйственном производстве и на предприятиях по переработке продуктов животноводства и сырья, уровень медицинского обслуживания и др.);
- разработка тактики специфической профилактики бруцеллеза.
Оценка потенциального риска заражения базируется, в основном, на результатах эпизоотологического обследования сельскохозяйственных животных, результатах диспансерного наблюдения за группами риска (включая лабораторное обследование), а также данных о заболеваемости людей на данной территории. Заболевания людей бруцеллезом часто являются индикатором неблагополучия по бруцеллезу сельскохозяйственных животных, т.к. они нередко выявляются на территориях, считающихся благополучными по бруцеллезу животных.
Особое внимание следует обратить на возможность миграции бруцелл козье-овечьего вида на крупный рогатый скот, в связи с чем резко возрастает эпидемиологическое значение этого вида животных.
3.5. Эпидемиологическое расследование случаев
заболевания людей
Эпидемиологическое обследование очага инфекции начинают в течение суток после получения экстренного извещения (учетная форма N 058/у) из лечебно-профилактического учреждения, а также сведений от ветеринарной службы, от специалистов или руководителей хозяйств независимо от форм их собственности, от индивидуальных владельцев сельскохозяйственных животных о случаях выявления в хозяйствах больных бруцеллезом животных.
В случае, если медицинский работник лечебно-профилактического учреждения при выявлении больного бруцеллезом (на амбулаторном приеме или при диспансерном профилактическом осмотре профессиональных групп) установит возможный профессиональный характер заболевания, он обязан независимо от подачи экстренного извещения об инфекционном заболевании (учетная форма N 058/у) направить в территориальный центр госсанэпиднадзора "Извещение об остром профессиональном отравлении или профессиональном заболевании" (учетная форма N 389/у).
Эпидемиологическое обследование случаев заболеваний людей бруцеллезом и выявление источника инфекции необходимо проводить с участием ветеринарных специалистов. При этом ветеринарным специалистом дается официальное письменное заключение на бланке ветеринарного учреждения о результатах проверки животных на бруцеллез.
Целью эпидобследования случаев заболевания людей бруцеллезом является выявление совместно со специалистами ветеринарной службы источника возбудителя инфекции, путей и факторов передачи, механизма заражения, выявление всех лиц, имевших контакт с источником возбудителя инфекции, и проведение комплексных мероприятий по предупреждению дальнейшего заражения людей бруцеллезом в данном очаге, а также возможно более раннее установление медицинского наблюдения за лицами, работающими в очаге бруцеллеза.
Эпидемиологическое обследование случаев обострений бруцеллеза у больных, уже состоящих на учете, целесообразно для выявления возможного повторного инфицирования и проведения соответствующих мероприятий.
Проводя обследование очага, врач-эпидемиолог должен определить характер контакта больного с животным (в результате профессиональной деятельности, при участии в сезонных работах с животными, контакт с животными личного хозяйства, случайный контакт с животными, с сырьем и продуктами животного происхождения).
В случае отсутствия контакта с животными собираются сведения об употреблении сырого молока, молочных и других продуктов животноводства, контакте с шерстью, шкурами, порядок их приобретения (на колхозных рынках, у частных или случайных лиц и т.д.), о работе больного в медицинских, ветеринарных или других лабораториях с возбудителем бруцеллеза или зараженным материалом.
Необходимые сведения о путях заражения, источнике инфекции может дать опрос самого больного, сотрудников, представителей администрации и др.
Важным в выявлении источника возбудителя инфекции является анализ эпизоотического состояния обследуемого района по бруцеллезу животных по данным ветеринарных органов и результатам эпизоотологического обследования хозяйства.
Для выявления путей заражения совместно со специалистами госветслужбы проводится комплексное обследование животноводческих хозяйств (овцетоварных, молокотоварных ферм, отгонных пастбищ, пунктов стрижки и др.), звероводческих хозяйств (ферм), индивидуальных хозяйств, предприятий по переработке сырья и продуктов животноводства (мясокомбинаты, молококомбинаты, убойные пункты, сыроваренные заводы и др.). Устанавливаются пространственные и временные границы очага.
Пространственная граница очага определяется территориями и восприимчивыми видами животных, в пределах которых возможна циркуляция возбудителя при данном механизме его передачи. Временные границы очага будут зависеть от многих факторов: количества заболевших животных, условий содержания и кормления животных, выполнения карантинных мероприятий и других требований.
Обследование проводит врач-эпидемиолог с привлечением санитарного врача, курирующего данный объект, при участии ветеринарного специалиста, а также в присутствии администрации.
При обследовании, в первую очередь, необходимо обратить внимание на соблюдение противобруцеллезного режима, изучить условия труда работников, для чего следует:
- оценить санитарно-гигиеническое состояние объекта, обратив особое внимание на благоустройство территории, водоснабжение, наличие дезинфицирующих и моющих средств, оборудование бытовых помещений для работников, их состояние и содержание, оборудование скотомогильников, ям Беккари или трупосжигательных печей, наличие уборочного инвентаря, в т.ч. для уборки абортированных и мертворожденных плодов и последов;
- выяснить наличие средств индивидуальной защиты персонала: спецодежда и обувь, рукавицы, резиновые (клеенчатые) фартуки, перчатки и др., их количество, пригодность для использования, порядок хранения, смены, централизации стирки, наличие аптечек, умывальников, дезинфицирующих средств, мыла и пр.;
- проверить организацию проведения профилактических диспансерных осмотров, профилактических прививок работников обследуемого объекта (время проведения прививок, правильность и полнота отбора контингентов, кем проводятся прививки, условия хранения вакцины и др.);
- в целях выявления алиментарного пути заражения проверить соблюдение режима пастеризации молока, условия хранения и обработки молочной посуды, фильтрующего материала, установить порядок реализации молока и молочных продуктов; организовать обследование животных, от которых получено молоко, а также других животных хозяйства; по возможности следует лабораторно исследовать подозреваемые молочные продукты;
- выявить порядок первичной обработки и транспортирования сырья и продуктов животноводства из обследуемого хозяйства.
Специалистами госсанэпидслужбы и госветслужбы составляется эпидемиологическое и эпизоотологическое заключение и совместно с руководителями хозяйств разрабатывается комплекс мероприятий по борьбе с бруцеллезом сельскохозяйственных животных, предупреждению заражения людей и ликвидации возникшего очага бруцеллеза.
В случае заболевания бруцеллезом работников ветеринарных, медицинских лабораторий, сотрудников научно-исследовательских учреждений, где ведутся работы с заразным материалом, с живыми культурами бруцелл, особое внимание необходимо уделить обследованию лабораторий в отношении соблюдения режима работы с заразным материалом.
При выявлении лиц, имевших возможность заразиться в данном очаге, - контактных не с больным человеком, а с предполагаемыми источниками или факторами передачи инфекции, необходимо организовать и проконтролировать проведение клинико-иммунологического обследования постоянного и временного персонала обследуемой фермы, пастбища, на перерабатывающем предприятии (цех, участок, пункт убоя скота и др.), а также членов семьи заболевшего, если заражение произошло от животных в индивидуальном хозяйстве. В случае, если лица проживают в другом населенном пункте, о них необходимо сообщить в центр госсанэпиднадзора по месту жительства для проведения их медицинского обследования.
Выявленные больные подлежат госпитализации и лечению.
Данные эпидемиологического обследования случая заболевания человека бруцеллезом заносятся в карту эпизоотолого-эпидемиологического обследования зоонозного заболевания (форма N 371-у). При этом указывают общие сведения о больном, дату заболевания, дату установления диагноза и госпитализации, сведения о клинической форме и характере течения заболевания, результаты лабораторного обследования больного, а также эпидемиологическое заключение о предполагаемом источнике, механизме и месте заражения. Проводят анализ причин заболеваемости, который служит дальнейшему совершенствованию профилактических мероприятий.
Если эпидемиологическое обследование проводится в связи с выявлением больных бруцеллезом животных, результаты проверки оформляются актом (совместно со специалистами ветеринарной службы), в котором следует отразить результаты выполнения противобруцеллезного режима, состояние профилактики заражения бруцеллезом работающих, организацию медицинского обследования лиц, контактных с источником инфекции, а также проверку противоэпидемических мероприятий. Составляются предложения (план-задание) по данному хозяйству (предприятию) с обязательной проверкой его выполнения в последующем.
В случае выявления грубых нарушений противобруцеллезного режима в животноводческих хозяйствах и на перерабатывающих продукты животноводства предприятиях, повлекших за собой заболевания людей бруцеллезом (в т.ч. детей и подростков), на виновных оформляются материалы для привлечения их к административной или уголовной ответственности.
Установление связи бруцеллеза с профессиональной деятельностью проводится в установленном порядке с обязательным участием врача-эпидемиолога и врача-инфекциониста. Основным документом, подтверждающим профессиональный характер заражения бруцеллезом, служит карта эпидобследования с заполненным вкладным листом и заверенная главным врачом центра госсанэпиднадзора.
4. ПРОФИЛАКТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА
Профилактика бруцеллеза включает комплекс ветеринарно-санитарных, хозяйственных и медико-санитарных мероприятий, конечной целью которых является ликвидация инфекции среди животных и прекращение заболеваний среди населения. Учитывая то, что бруцеллез - зоонозная инфекция, основой эпидемического благополучия являются меры по профилактике инфекции среди животных и ликвидации очагов эпизоотии в случае их возникновения. Перечень общих профилактических мероприятий, обязательных для учреждений, должностных лиц и граждан Российской Федерации определен санитарными правилами СП 3.1.085-96 и Ветеринарными правилами ВП 13.3.1302-96 "Бруцеллез".
Медико-санитарные мероприятия по профилактике бруцеллеза включают: 1) защиту людей от инфицирования; 2) вакцинопрофилактику; 3) профилактические осмотры профессиональных контингентов и 4) санитарно-просветительную работу.
4.1. Мероприятия по защите людей от инфицирования
Мероприятия по предупреждению заболеваний бруцеллезом людей следует проводить согласно региональным и местным программам по борьбе и профилактике бруцеллеза в республике, области (крае), районе и в каждом отдельном хозяйстве, предприятии. Программы составляются с участием всех заинтересованных ведомств и организаций и финансируются из средств местного бюджета.
Защита людей от инфицирования осуществляется как проведением широких общесанитарных мер, так и использованием средств индивидуальной защиты:
- обеспечение должного санитарно-гигиенического состояния хозяйств и предприятий, соблюдение дезинфекционного режима;
- соблюдение правил убоя животных из хозяйств, неблагополучных по бруцеллезу, с последующей дезинфекцией оборудования, помещений и обеззараживание отходов, дезинфекцией транспорта, которым перевозились больные животные;
- соблюдение установленных правил обработки и использования продуктов убоя и молока от животных из хозяйств, неблагополучных по бруцеллезу;
- соблюдение правил работы с животными в хозяйствах: обеспечение персонала, в т.ч. лиц, временно привлекаемых к работам, связанным с риском заражения бруцеллезом, средствами личной гигиены и индивидуальной защиты (халаты, резиновые перчатки, нарукавники, клеенчатые фартуки, специальная обувь и др.), своевременная их замена и стирка;
- наличие и правильная эксплуатация бытовых помещений, комнат для отдыха, мест приема пищи, душевых и др.;
- обеспечение горячей водой, моющими средствами, дезинфицирующими средствами;
- организация в хозяйствах и на предприятиях централизованной дезинфекции, стирки и чистки спецодежды;
- обязательный инструктаж работников по правилам гигиены, использованию средств индивидуальной защиты, соблюдению противобруцеллезного режима; аналогичный инструктаж должны проходить индивидуальные владельцы сельскохозяйственных животных;
- допуск к работам, связанным с риском заражения бруцеллезом, только после прохождения инструктажа и проведения в установленном порядке профилактических противобруцеллезных прививок.
Контроль в порядке государственного санитарно-эпидемиологического надзора за организацией и проведением противобруцеллезных мероприятий и соблюдением противобруцеллезного режима в животноводческих и индивидуальных хозяйствах, на предприятиях, перерабатывающих продукты и сырье животного происхождения, в лабораториях, работающих с вирулентными культурами, в части предупреждения заболеваний людей осуществляется центрами госсанэпиднадзора.
Плановые обследования по соблюдению противобруцеллезного режима в животноводческих хозяйствах, на отгонных пастбищах, убойных пунктах, пунктах стрижки овец, мясо- и молококомбинатах и других предприятиях, где имеется риск заражения бруцеллезом, следует проводить эпидемиологам совместно с санитарными врачами, курирующими данные объекты, а также с ветеринарными специалистами. Частота плановых обследований зависит от эпизоотической ситуации. Результаты обследования объекта следует доводить до администрации для принятия соответствующих мер.
4.2. Профилактическая вакцинация людей против бруцеллеза
Показанием к вакцинации людей является угроза заражения В.melitensis в связи с распространением бруцеллеза среди овец и коз, а также при установленной миграции бруцелл этого вида на крупный рогатый скот или другой вид животных.
В районах, свободных от бруцеллеза козье-овечьего вида, иммунизация персонала хозяйств, неблагополучных по бруцеллезу, вызванному В.abortus, suis, ovis, canis, не проводится.
Прививки постоянным и временным работникам животноводства проводятся до полной ликвидации в хозяйствах бруцеллеза козье-овечьего вида, а персоналу предприятий по переработке сырья и продуктов животноводства - до полной ликвидации бруцеллеза в хозяйствах, откуда поступает скот, сырье и продукты животноводства. Прививкам подвергаются также работники бактериологических лабораторий, работающие с живыми культурами бруцелл и с зараженными животными.
Для иммунизации людей против бруцеллеза используется сухая живая вакцина, приготовленная из вакцинного штамма коровьего вида (В.abortus 19-BA).
Эпидемиологическая эффективность прививок зависит от правильного определения показаний к их проведению, полноты отбора подлежащих иммунизации профессиональных групп, в т.ч. временного персонала, соблюдения сроков вакцинации, методики проведения прививок, иммунологических свойств вакцины и соблюдения необходимых условий ее хранения.
Контроль за планированием и проведением прививок возлагается на центры госсанэпиднадзора.
Перед прививками проводится медицинский осмотр всех лиц, подлежащих вакцинации с обязательным серологическим (р. Хеддлсона или ИФА) и аллергическим (проба Бюрне с бруцеллезным аллергеном или реакция лизиса лейкоцитов) обследованием. Вакцинации подлежат лица с четкими отрицательными серологическими и аллергическими реакциями на бруцеллез.
Прививки не проводятся лицам моложе 18 лет, женщинам в период беременности и грудного вскармливания, т.к. эти контингенты не должны привлекаться к работам, связанным с риском заражения бруцеллезом, а также лицам, имевшим положительные серологические или аллергические реакции на бруцеллез на протяжении последних 2 лет.
К работе с инфицированными животными или сырьем от них люди могут допускаться не ранее чем через 1 месяц после прививок. Иммунитет сохраняет наивысшую напряженность в течение 5 - 6 месяцев. В связи с этим при определении сроков прививок в животноводческих хозяйствах необходимо строго руководствоваться данными о времени окота (ранний окот, плановый, внеплановый).
Ревакцинация проводится через 10 - 12 месяцев после вакцинации лицам с отрицательными серологическими и аллергическими реакциями на бруцеллез.
Прививки против бруцеллеза могут быть достаточно эффективными лишь при одновременном проведении всего комплекса санитарных и ветеринарных мероприятий.
4.3. Диспансерные профилактические осмотры
профессиональных контингентов
С целью своевременного выявления заболевших бруцеллезом людей обязательным диспансерным профилактическим осмотрам при поступлении на работу и не реже 1 раза в год подлежат контингенты, подвергающиеся риску заражения бруцеллезом:
- постоянные и временные работники животноводческих, звероводческих хозяйств (ферм), как благополучных, так и неблагополучных по бруцеллезу любого вида скота, лица, занятые обслуживанием, стрижкой, убоем животных, первичной обработкой и транспортированием сырья и продуктов животноводства из этих хозяйств;
- постоянные и временные работники предприятий по переработке сырья и продуктов животноводства, поступающих из районов и хозяйств, неблагополучных по бруцеллезу любого вида;
- медицинский, ветеринарный, зоотехнический и другой персонал, работающий с живыми культурами бруцелл или зараженным материалом, с больными и подозрительными в заражении бруцеллезом животными.
Диспансерным профилактическим осмотрам подлежат работники всех хозяйств и предприятий независимо от форм их собственности.
Руководство и организация диспансеризации осуществляется органами управления здравоохранением. Центры госсанэпиднадзора контролируют охват контингентов, подлежащих периодическим медицинским осмотрам на бруцеллез, составляют перечень объектов с числом работающих в них, оценивают значение неблагоприятных производственных факторов. Перечень объектов корректируется не реже одного раза в 2 года.
Администрация отобранных объектов представляет поименные утвержденные списки работающих, подлежащих периодическим медицинским осмотрам на бруцеллез.
Основным специалистом, проводящим периодические медицинские осмотры, является терапевт (территориальный или цеховой). При этом проводится серологическое обследование на бруцеллез в реакции Хеддлсона или ИФА. На территориях с длительным благополучием по бруцеллезу сельскохозяйственных животных (не менее 5 лет) серологическое обследование проводят один раз в два года.
Лица, положительно реагирующие на бруцеллез, больные с клиническими проявлениями, характерными для бруцеллезной инфекции (поражение опорно-двигательного аппарата, нервной системы, нарушение слуха, зрения, воспалительные заболевания мочеполовой системы и др.), подлежат углубленному медицинскому осмотру с привлечением специалистов по профилю клинических проявлений (инфекционист, невропатолог, гинеколог, уролог, хирург и др.).
Лица с положительными и сомнительными серологическими реакциями без клинических проявлений (группа положительно реагирующих на бруцеллез) подлежат тщательному обследованию в динамике врачом-инфекционистом два раза в год с обязательным лабораторным исследованием сыворотки крови на бруцеллез и при необходимости специалистами по профилю выявленной патологии.
Уточнение или подтверждение диагноза проводится в инфекционных стационарах (отделении, больнице) врачом-инфекционистом.
Профилактические медицинские осмотры животноводов следует проводить через 1 - 2 месяца после окончания массового окота и отела животных (обычно II квартал), работников предприятий по переработке сырья и продуктов животноводства - через 1 - 2 месяца после массового убоя скота (не позднее III квартала).
Лица, временно привлекаемые к уходу за животными и к переработке сырья и продуктов животноводства, обследуются через 1 - 2 месяца после сезонных работ. Контроль за полнотой охвата этих контингентов осуществляет санитарно-эпидемиологическая служба.
Во время проведения периодических медицинских осмотров и лабораторного обследования широко проводится санитарно-просветительная работа среди обследуемых контингентов.
4.4. Гигиеническое воспитание населения
Целью гигиенического воспитания является доведение до широких слоев населения необходимых санитарно-гигиенических знаний.
Основными задачами гигиенического воспитания по вопросам профилактики бруцеллеза являются:
Формирование у населения четкого представления о том, что бруцеллез - зоонозная инфекция, при которой источником заболевания являются больные сельскохозяйственные животные. Доведение информации о распространении болезни среди животных, путях заражения бруцеллезом и степени опасности для человека, обратив внимание на профессиональный характер заболевания.
Ознакомление населения с основными мерами профилактики бруцеллеза, особо подчеркнув важность своевременного выявления заболевших животных, необходимость их изоляции и проведения санитарных, специальных ветеринарных, дезинфекционных и других мероприятий; значение мероприятий по охране благополучных хозяйств от заноса инфекции; необходимость соблюдения мер личной гигиены; недопущение детей и подростков к уходу за больными животными как в общественных, так и личных хозяйствах; необходимость термической обработки пищевых продуктов животного происхождения; значение прививок против бруцеллеза.
Населению необходимо постоянно объяснять, что профилактика бруцеллеза включает комплекс хозяйственных, санитарных, ветеринарных и медицинских мероприятий.
В зависимости от особенностей групп населения, среди которых проводится эта работа, следует акцентировать внимание на вопросах предупреждения заражения среди профессиональных групп. Для работников животноводства следует показать наносимый бруцеллезом экономический ущерб, подчеркнуть, что от них зависит выявление первых случаев абортов у животных, проведение срочных дезинфекционных мер, что способствует оздоровлению стада и всего хозяйства.
Работников животноводческих (звероводческих) хозяйств (ферм), предприятий, перерабатывающих сырье и продукты животного происхождения, наиболее подробно следует ознакомить с мерами личной профилактики, их правами и правилами по обеспечению их спецодеждой, а также всем необходимым для выполнения мер личной профилактики.
Для лиц, имеющих в личных хозяйствах коз, овец и других сельскохозяйственных животных, важно подчеркнуть значение своевременности проведения санитарных и ветеринарных мер при первых признаках заболевания животных бруцеллезом, отметить, что нарушение и несоблюдение их приводит к дальнейшему распространению инфекции и заражению людей, к большим экономическим убыткам.
Необходимо подчеркнуть опасность заражения бруцеллезом детей и подростков, если они принимают участие в уходе за больными животными.
Не следует детально останавливаться на клинике бруцеллеза у людей, достаточно отметить лишь основные симптомы, подчеркнуть, что диагностировать это заболевание может только врач.
Пропаганда гигиенических знаний среди населения будет эффективна, если использовать конкретные случаи из практики, привести примеры успешной борьбы с бруцеллезом на конкретных территориях.
5. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА
Для лабораторной диагностики бруцеллеза у людей применяются три группы методов: первая - тесты, позволяющие выявить возбудитель заболевания и его растворимые антигены; вторая - методы определения специфических антител; третья - тесты, выявляющие сенсибилизацию организма к бруцеллезным антигенам.
5.1. Методы выделения возбудителя заболевания
и его растворимых антигенов
5.1.1. Бактериологический метод
Вся работа по выделению и дифференциации бруцелл из любого исследуемого материала должна проводиться в условиях, предупреждающих возможность инфицирования персонала и обсеменения возбудителем объектов внешней среды, в строгом соответствии с санитарными правилами "Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности. СП 1.2.011-94".
Характерной особенностью рода Brucella является медленный рост на питательных средах, особенно в первых генерациях. При посевах крови, костного мозга и мочи культуры бруцелл обнаруживаются через 5 - 10 дней, а иногда через 20 - 30 дней после засева. При этом первые генерации культур В.abortus и В.ovis способны расти только при наличии в атмосфере повышенного содержания углекислоты (5 - 10%). Биовары В.abortus 5, 6 и 7 могут расти в обычных аэробных условиях.
Для выделения культур бруцелл рекомендуются следующие среды: сывороточно-декстрозный агар, агар из картофельного настоя + сыворотка и кровяной агар (5% овечьей крови в среде), Albimi - агар, среда "Д", печеночные и мясопептонные агары и бульоны (pH сред - 6,8 - 7,2). Рецепты приготовления сред приведены в конце указаний. В настоящее время в практике широко используется коммерческая среда для выделения бруцелл - эритрит агар (г. Махачкала). Следует отметить, что данная среда является высокоэффективной для выделения первой генерации возбудителя. Однако при последующих пересевах на этом агаре изучаемая культура бруцелл может диссоциировать.
Посевы следует производить на предварительно проверенные питательные среды.
Для проверки агара из 2-суточной культуры В.melitensis или В.abortus готовят суспензию бруцелл в концентрации 200 мк в 1 мл (по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Посев проводят на 4 чашки по 0,1 мл - 20 мкл суспензии. Агар признается пригодным, если через 5 суток пребывания в термостате при 37 °C в среднем вырастает не менее 18 колоний на чашку.
Исследование крови и другого биологического материала.
Посевы крови рекомендуется делать во время лихорадочного состояния больного, т.к. в этот период наблюдается наибольший процент выделения культур. Однако не исключена возможность получения гемокультуры и при нормальной температуре. Кровь для посева следует брать до лечения антибиотиками. Посевы крови рекомендуется проводить во флаконы (желательно прямоугольные) емкостью 100 - 200 мл, в которые наливают по 30 - 50 мл агара. После стерилизации их укладывают так, чтобы агар застыл на одной из сторон флакона. Затем в каждый флакон стерильно добавляют по 25 - 30 мл предварительно простерилизованного бульона и выдерживают в термостате при 37 °C в течение 2 - 3 суток (агар с бульоном может быть использован не позднее 5 - 7 дней). Кровь в количестве не менее 10 мл стерильно берут шприцем из локтевой вены и засевают по 5 мл в два флакона. Один из флаконов инкубируют при повышенном содержании углекислоты (5 - 10%), а другой - в обычных условиях. Начиная с четвертого дня после посева, флаконы просматривают и при отсутствии роста культуры поверхность агара орошают бульоном. При положительном результате на поверхности агара появляются колонии бруцелл. Если в течение месяца бруцеллы не обнаруживаются, то в этом случае делают контрольный высев из бульона на твердую питательную среду. При бактериологическом обследовании больных, прошедших курс лечения антибиотиками, через 1 месяц и спустя 4 - 6 месяцев после окончания курса антибиотикотерапии, а также больных хронической формой бруцеллеза в период обострения (особенно при субфебрилитете) перед началом лечения рекомендуется проводить посевы крови, пунктатов костного мозга и лимфатических узлов на специальную питательную среду для выделения L-культур бруцелл (состав питательной среды см. в конце указаний).
Способ посева бактериологического материала для выделения L-культур идентичен с методом выделения бактериальных гемокультур. Посевы выдерживаются в термостате не менее 35 - 40 дней.
Бруцеллы можно выделить также из костного мозга, мочи, спинномозговой жидкости, экссудата из бурситов, грудного молока, желчи, мокроты, трупного материала и т.д. Посевы проводят на твердые и жидкие питательные среды. В случаях исследования загрязненного материала для задержки роста посторонней микрофлоры к среде следует добавлять генцианвиолет из расчета 1:200000. С этой целью также добавляют различные антибиотики, в частности полимиксин - 3 мкг/мл и амфоглюкамин - 3 мкг/мл.
5.1.2. Биологический метод
Для выделения бруцелл из материалов, загрязненных посторонней микрофлорой и при малой концентрации бруцелл в исследуемом материале, используются морские свинки (весом 300 - 350 г) или белые мыши (весом 17 - 18 г). Исследуемый материал вводят подкожно в паховую область в дозах не более 0,5 мл для мышей и 1 мл для морских свинок.
Вскрытие белых мышей производится через 20 - 25 дней, а морских свинок - через 30 - 35 дней после введения исследуемого материала. Перед вскрытием у свинок следует взять кровь из сердца для исследования сыворотки в реакции агглютинации. Для посевов у морских свинок берут целиком лимфатические узлы (регионарные к месту введения исследуемого материала): паховый, подчелюстной, шейный, парааортальный, кусочки селезенки, печени, костный мозг, кровь, мочу; у белых мышей лимфатические узлы: паховый, акселярный, парааортальный, подчелюстной, кусочки селезенки и печени. Лимфатические узлы, кусочки печени и селезенки помещают в стерильную чашку. Костный мозг для засева берут пипеткой из рассеченной бедренной кости. Посевы крови из сердца, а также мочи и костного мозга производят стерильной пипеткой непосредственно на питательные среды (агар и бульон). Лимфатические узлы животных перед посевом рекомендуется надсекать ножницами. После этого каждый лимфатический узел и кусочки органов (по возможности больше) берут "уколом" стерильной деревянной палочки (палочка должна быть длиной 25 - 30 см, диаметром 4 - 5 мм, хорошо отструганная, с несколько заостренным концом) и вносят первоначально в пробирку с агаром, где той же палочкой материал раздавливают и тщательно втирают в поверхность питательной среды. Затем остатки посевного материала переносят в пробирку с бульоном. После использования палочки погружают на 1 час в дезраствор (5% раствор фенола), затем автоклавируют, после чего тщательно промывают и стерилизуют для последующего употребления. Посевы выдерживают при 37 °C в термостате 20 - 25 дней. Просмотр посевов на пробирках с агаром и бульоном производят каждые 3 - 4 дня, из помутневших бульонов делают высевы на пробирки со скошенным агаром.
Результат исследования оценивается положительно при выделении хотя бы одной колонии бруцелл из организма животного или при наличии положительной реакции Райта у животных в титре не менее 1:20.
5.1.3. Методы идентификации бруцелл
Для определения принадлежности выделенных культур к роду Brucella можно использовать следующие методы: изучение морфологии колоний, микроскопия окрашенных препаратов по Граму или Козловскому, люминесцентная микроскопия и проба со специфической сывороткой в реакции агглютинации на стекле.
Морфология колоний.
Колонии бруцелл на агаре бесцветны, выпуклы (холмиком), с гладкой поверхностью, гомогенны, иногда с нежной зернистостью в центре колонии. С возрастом нежные и прозрачные колонии постепенно мутнеют.
Величина колоний может быть различной. Наряду с крупными, достигающими в диаметре 3 - 4 мм и больше, могут быть очень мелкие - точечные колонии 0,1 - 0,05 мм. Различные факторы (pH питательной среды, влажность, наличие бактериофага в культуре и др.), влияющие на биологию культуры, могут привести также к изменению внешнего вида колоний (встречаются зернистые, стекловидные колонии, растущие в толще агара, эрозированные, сухие, слизистые, радиально исчерченные и др.).
Для изучения структуры колоний целесообразно использовать стереоскопическую лупу МБС-1 или обычный микроскоп с объективом наименьшего увеличения.
Микроскопия окрашенных препаратов.
При окраске по Граму бруцеллы грамотрицательны (окрашиваются в красный цвет). Окрашивание препаратов по способу Козловского: препараты, фиксированные на пламени горелки или спиртовки, окрашивают 0,5% водным раствором сафранина при подогревании до появления пузырьков, промывают дистиллированной водой и докрашивают 0,5%-ным водным раствором малахитовой или бриллиантовой зелени в течение 40 - 50 секунд. Бруцеллы сохраняют красную окраску сафранина, а остальные бактерии окрашиваются в зеленый цвет.
Проба со специфической сывороткой.
Для предварительной, быстрой идентификации ставят реакцию агглютинации на стекле. На предметное стекло наносят каплю специфической сыворотки, разведенной 1:25 0,5% карболизированным физиологическим раствором, в которой эмульгируется одна петля исследуемой культуры. В положительных случаях быстро (в течение 1 минуты) наступает агглютинация с образованием хорошо выраженных хлопьев, в отрицательных - суспензия остается гомогенной. Для контроля исследуемую культуру эмульгируют в капле нормальной сыворотки или физиологическом растворе.
Люминесцентная микроскопия (см. раздел 4 "Идентификация бруцелл в воде и пищевых продуктах").
5.1.4. Методы идентификации L-форм бруцелл
Для определения принадлежности выделенных L-культур к роду Brucella можно использовать следующие методы: изучение характера роста и морфологии колоний, микроскопия нативных препаратов, проба со специфической сывороткой в реакции агглютинации на стекле, а также способность к росту на специфической питательной среде с пенициллином.
Характер роста и морфологии L-форм бруцелл.
L-колонии бруцелл могут быть изолированными или в виде нежного сплошного налета. Колонии от 2 до 3 мм имеют золотистый цвет, слизистую консистенцию, часто врастают в агар. При просмотре через бинокулярную лупу МБС-1 L-колонии имеют вид "яичницы" - плотный центр и ажурные светлые края.
Микроскопия нативных препаратов.
Для изучения морфологии L-клеток отбирают характерные колонии и из них готовят нативные препараты: на предметное стекло наносят каплю физиологического раствора, в которой эмульгируют одну каплю исследуемой культуры, закрывают покровным стеклом, края заливают парафином и просматривают в световом микроскопе в фазовом контрасте с иммерсией.
По морфологии L-формы бруцелл представляют собой полиморфные клетки в виде шаров, грушевидных и неправильной формы тел от 1 до 6 мкм с цитоплазмой разной оптической плотности с вакуолями и зернистостью. Зерна-гранулы могут располагаться как внутри крупных клеток, так и лежать свободными зернистыми массами. В препарате могут находиться клетки от 0,2 до 0,5 мкм гетероморфные или близкие по морфологии к нормальным клеткам бруцелл.
Проба со специфической сывороткой.
L-культуры бруцелл сохраняют антигенное родство с исходными штаммами бруцелл. Для предварительной быстрой идентификации L-культур бруцелл ставят реакцию агглютинации на стекле со специфической агглютинирующей поливалентной антисывороткой в разведении 1:25. Необходимо учитывать, что L-культуры бруцелл очень плохо эмульгируются, что затрудняет учет реакции. Поэтому рекомендуется сначала петлю культуры тщательно растереть стеклянной палочкой в небольшом количестве физиологического раствора и после этого каплю эмульсии перенести в каплю специфической сыворотки на предметном стекле и параллельно в каплю нормальной сыворотки или физиологического раствора в качестве контроля.
Скорость специфической реакции агглютинации может быть только замедленной. Характер агглютината при положительной реакции обычен.
5.1.5. Методы дифференциации бруцелл
После идентификации культуры бруцелл проверяют на диссоциацию. С этой целью применяют следующие тесты: проба с трипафлавином и реакция термоагглютинации (проба с нагреванием).
Проба с раствором трипафлавина (на стекле).
На предметное стекло наносят каплю солевого (0,85%) раствора трипафлавина 1:500, в котором эмульгируется капля испытуемой культуры. У диссоциированных культур быстро через 1 - 2 минуты наступает агглютинация с образованием хорошо выраженных хлопьев. Взвесь из S-форм культур остается гомогенной.
Реакция термоагглютинации.
9
2 - 3 мл 1 x 10 мкл/мл двухсуточной культуры бруцелл в
физиологическом растворе подогревают в пробирке на водяной бане
при 90° в течение 30 минут. Результаты учитывают через 30 минут, 1
час и окончательно через 24 часа пребывания при комнатной
температуре. В эти сроки наступает, при наличии диссоциации, ясно
выраженная агглютинация клеток бруцелл, тогда как суспензия
недиссоциированных (S) штаммов остается гомогенной. Дифференциации
подлежат культуры бруцелл, находящиеся только в S-форме.
Тестами дифференциации бруцелл являются: их отношение к росту в присутствии CO2, образование H2S, устойчивость к фуксину и тионину, способность агглютинироваться монорецепторными сыворотками, отношение к фагу "Тб".
Дифференциация по образованию сероводорода.
В качестве реактива применяют водный раствор уксусно-кислого свинца, в котором смачивают полоски фильтровальной бумаги размером 1 x 8 см. Полоски затем просушивают. Заготовленные впрок сухие полоски фильтровальной бумаги хранят в банке из темного стекла с притертой пробкой не более 1 - 2 месяцев.
9
Взвесь испытуемой культуры в физиологическом растворе (2 x 10
мкл в 1 мл) засевают стандартной петлей (2 мм) на скошенную
поверхность печеночного агара (pH - 6,8 - 7,2). Затем берут
полоску фильтровальной бумаги и зажимают между пробиркой и ватной
пробкой так, чтобы нижний ее конец свободно свисал над верхним
краем посева и не касался агаровой среды. Ватная пробка должна
быть рыхлой, не задерживать выхода из пробирки углекислоты.
Пробирки с посевами ставят в термостат при 37 °C.
Показателем интенсивности образования сероводорода является почернение нижнего, свисающего над посевом конца бумажки. Почернение бумажки измеряется в мм.
Результаты учитываются через 2 дня в течение 6 дней. При каждом учете темневшую бумажку заменяют новой. Для окончательной оценки способности культуры к образованию сероводорода все три показателя складывают.
Для В.suis (биовар 1) суммарный показатель образования сероводорода равен примерно 12 - 20 мм, для В.abortus (биовар 1) - около 5 - 7, В.melitensis (биовар 1), как правило, совсем не образует сероводорода или вызывает только легкое побурение свинцовой бумажки. У штаммов В.neotomae показатель образования сероводорода в среднем равен 5 - 8 мм. Культуры В.ovis и В.canis сероводорода не образуют.
Дифференциация по редуцирующей активности в отношении красок.
Для этого метода дифференциации рекомендуется применять твердые питательные среды - агар Albimi и мясо-пептонный агар. Применяют основной фуксин и тионин, предварительно оттитрованные по отношению к трем основным видам референтных штаммов бруцелл, в концентрации: фуксин - 1:50000, тионин - 1:50000.
При отсутствии стандартных оттитрованных красок рабочие их дозы можно оттитровать с использованием эталонных штаммов бруцелл. Для этого испытуемые краски добавляют к среде в различных концентрациях. Концентрация красок в среде, с которой получается четкая дифференциация эталонных штаммов бруцелл (В.melitensis 16M, В.abortus 544, В.suis 1330), и являются рабочей дозой данной краски. Основные растворы фуксина и тионина готовят в концентрации 1:1000 (0,1 г краски, 20 мл 96° спирта и 80 мл дистиллированной воды). Флаконы с краской хранят в темном месте в течение 6 - 10 месяцев. Готовят питательную среду с краской следующим образом: к 100 мл охлажденного до 45 - 50 °C агара стерильно добавляют 2 мл основного раствора краски для получения концентрации 1:50000.
Питательную среду с краской разливают пипеткой по 20 - 25 мл в каждую чашку Петри. Затем среду подсушивают, не открывая чашки. Среды с красками должны храниться в холодильнике (+4 °C) и пригодны для работы в течение 10 - 15 дней. Обесцвеченные среды применять нельзя.
Взвесь бруцелл готовят из двухсуточной агаровой культуры. Посевы контрольных (эталонных штаммов всех трех видов бруцелл) и испытуемых штаммов производят петлей диаметром 2 мм из взвеси, содержащей в 1 мл 2 млрд. микробных клеток (по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Одну петлю такой взвеси засевают штрихом на поверхность агара. На чашку можно одновременно засевать 4 - 6 культур, предварительно разделив чашку Петри на 4 - 6 секторов. Посевы помещают в термостат при 37 °C. Учет результатов проводят через трое суток инкубации.
Схема учета:
- интенсивный рост по всему штриху 4+;
- интенсивный рост вначале и более слабый в конце штриха 3+;
- менее интенсивный в начале или слабый рост по всему штриху 2+;
- очень слабый рост по ходу штриха или отдельные колонии +.
Реакция агглютинации с монорецепторными и R-сыворотками.
Монорецепторную сыворотку последовательно разводят до ее предельного титра (1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 и т.д. в объеме 0,5 мл). В качестве антигена применяют смыв в физиологическом растворе 2-суточной агаровой культуры бруцелл изучаемого штамма, разведенного до 2 млрд. микробных клеток в 1 мл (по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Для разведения сыворотки и антигена применяют физиологический раствор, pH 7,0. Антиген добавляют по 0,5 мл во все пробирки. Разведение сыворотки удваивается (1:10, 1:20 и т.д.).
Реакцию ставят с двумя контролями: а) контроль с эталонным штаммом вида В.melitensis; б) контроль с эталонным штаммом В.abortus. Пробирки со смесью сыворотки и антигена выдерживают в термостате при температуре 37 °C 18 - 20 часов, а затем в течение 2 часов при комнатной температуре. После этого проводят учет реакции. Реакция считается положительной, начиная с разведения сыворотки 1:20 , но не менее чем на 2+.
Для культур бруцелл вида ovis и canis, а также для культур других видов и биоваров бруцелл, находящихся в R-форме, для реакции агглютинации используют анти-R-сыворотку. Техника постановки реакции аналогична. Используется физиологический раствор на фосфатном буфере, pH 8,2 - 8,4.
Определение чувствительности культур бруцелл к фагу.
Бруцеллезный фаг "Тб" избирательно лизирует бруцеллы вида abortus, находящиеся в S-фазе. При определении чувствительности бруцелл к фагу используют следующий метод:
Питательная среда - 1,5% мартеновский агар (можно 1,5% агар Альбими) разливают в чашки Петри по 25 - 30 мл. Среду подсушивают при комнатной температуре в течение 18 - 20 часов. Чашки можно открыть и прикрыть их стерильными кружками фильтровальной бумаги, но в этом случае желательно чашки держать под лучами бактерицидной лампы.
Для посева используют 48-часовую агаровую культуру бруцелл, из
которой готовят взвесь в физиологическом растворе из расчета
9
1 x 10 мкл в 1 мл, 0,4 - 0,5 мл из этой взвеси наливают на
поверхность агара. Затем чашки тщательно раскачивают для пол

ТЕЛЕГРАММА ЦБ РФ от 30.01.2003 n 33-4-7/504 <ОБ ОТЗЫВЕ ЛИЦЕНЗИИ НА ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ БАНКОВСКИХ ОПЕРАЦИЙ У АКБ РАЗВИТИЯ ЛЕСОПРОМЫШЛЕННОГО КОМПЛЕКСА ЛЕСОБАНК (ЗАО)>  »
Постановления и Указы »
Читайте также