ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУ 4.2.1097-02 (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 15.01.2002)


Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
15 января 2002 года
Дата введения -
1 апреля 2002 года
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУ 4.2.1097-02
1. Разработаны сотрудниками Министерства здравоохранения Российской Федерации Ю.М. Федоровым, Н.Я. Жилиной; Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института Ю.М. Ломовым, Б.Н. Мишанькиным, Л.С. Подосинниковой, Л.Г. Воронежской, И.Я. Черепахиной, Т.А. Кудряковой, Б.Л. Мазрухо, Л.М. Смоликовой, И.В. Рыжко, Р.И. Цураевой, Э.А. Москвитиной, Б.П. Голубевым; Противочумного Центра Минздрава России А.А. Кюрегяном, С.М. Ивановой, Ю.С. Королевым; Российского научно-исследовательского противочумного института "Микроб" А.К. Адамовым, З.В. Малыхиной, Т.В. Бугорковой, Н.И. Смирновой, Л.Ф. Ливановой; Иркутского научно-исследовательского противочумного института А.С. Марамовичем, В.С. Ганиным, Л.Я. Урбанович, В.И. Погореловым; Ставропольского научно-исследовательского противочумного института В.Н. Савельевым; Причерноморской противочумной станции Г.В. Гальцевой; Государственного Центра по антибиотикам С.В. Сидоренко; Российской медицинской академии последипломного образования Е.А. Ведьминой; ГИСК им. Л.А. Тарасевича Минздрава России Т.И. Анисимовой, Л.В. Саяпиной.
2. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г. Онищенко 15 января 2002 г.
3. Введены взамен "Инструкции по организации и проведению противохолерных мероприятий", утвержденной МЗ и МП РФ от 09.06.95 N 01-19/50-11.
1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
1.1. Настоящие Методические указания разработаны для внедрения и применения санитарно-эпидемиологических правил СП 3.1.1086-02 "Профилактика холеры. Общие требования к эпидемиологическому надзору" в части, касающейся организации и проведения лабораторной диагностики холеры.
1.2. Настоящие Методические указания предназначены для специалистов бактериологических лабораторий центров госсанэпиднадзора, лечебно-профилактических и противочумных учреждений.
2. НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ
2.1. Санитарные правила по безопасности работ с микроорганизмами СП 1.2.006-93. Ч. I: Порядок выдачи разрешения на работу с микроорганизмами I - IV групп патогенности и рекомбинантными молекулами ДНК.
2.2. Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности: СП 1.2.011-94.
2.3. Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности: СП 1.2.036-95.
2.4. Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами: СП 1.2.731-99.
2.5. Условия транспортирования и хранения медицинских иммунобиологических препаратов: СП 3.3.2.028-95.
2.6. Профилактика холеры. Общие требования к эпидемиологическому надзору: СП 3.1.1086-02.
2.7. Профилактика холеры. Организационные мероприятия. Оценка противоэпидемической готовности медицинских учреждений к проведению мероприятий на случай возникновения очага холеры: МУ 3.1.1096-02.
3. ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ ХОЛЕРЫ
Холера - острая инфекционная болезнь из группы карантинных инфекций, с диарейным синдромом, фекально-оральным механизмом передачи возбудителя, водным, пищевым и контактно-бытовым путями распространения инфекции.
Холерные вибрионы относятся к виду V. cholerae, который включает как патогенные, способные вызывать заболевания, склонные к эпидемическому и пандемическому распространению, так и свободноживущие в воде вибрионы, безопасные для человека или обусловливающие спорадические случаи диарей и инфекций с внекишечной локализацией возбудителя. Известно около 200 О-серологических групп холерных вибрионов, из которых лишь холерные вибрионы O1 серогруппы до последнего десятилетия являлись возбудителями грозной инфекции. С 1993 г. по решению ВОЗ как холеру регистрируют заболевания, вызываемые холерными вибрионами O139 серогруппы. Таким образом, к настоящему времени известны три варианта возбудителя холеры: холерные вибрионы O1 серологической группы - классические и эльтор (варианты Огава, Инаба, Гикошима) и холерные вибрионы новой O139 серогруппы.
Наличие гена холерного токсина (ctx AB), независимо от его экспрессии, отличает токсигенные (эпидемические) от свободноживущих холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп; кроме того, в геноме токсигенных эпидемически значимых вариантов присутствует ряд генов, кодирующих синтез белка ТОХ Т, передающего сигналы запуска синтеза холерного токсина (СТ), токсинкорегулируемых пилей адгезии (TCP) и фактора колонизации (ACF). Известно, что свободноживущие атоксигенные холерные вибрионы O1 чрезвычайно редко имеют tcp ген в своей хромосоме.
Характеристика генома выделенных штаммов молекулярно-биологическими методами может быть использована для эпидемиологического анализа и решения вопросов заноса, распространения и укоренения инфекции.
Известно многообразие фенотипических изменений атоксигенных холерных вибрионов, выделенных на свободных от холеры территориях, а также распространение эпидемически значимых фагорезистентных вариантов холерных вибрионов и штаммов с множественной лекарственной устойчивостью.
4. ОРГАНИЗАЦИЯ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Диагностические исследования на холеру в регламентированном объеме могут проводить:
- бактериологические лаборатории территориальных центров госсанэпиднадзора, лечебно-профилактических учреждений и ведомственных служб, имеющие разрешение на работу с микроорганизмами III группы патогенности;
- лаборатории особо опасных инфекций центров госсанэпиднадзора в субъектах Федерации (республиканских, краевых, областных, городских), ведомственных учреждений, имеющие разрешение на проведение диагностических исследований на холеру;
- лаборатории противочумных учреждений, имеющие разрешение на проведение диагностических исследований на холеру и на работу с возбудителем холеры.
Организация и выполнение диагностических исследований на холеру в лабораториях должны осуществляться в соответствии с требованиями, регламентирующими:
- безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами - для бактериологических лабораторий центров госсанэпиднадзора, лечебно-профилактических учреждений и ведомственных служб;
- безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности - для лабораторий особо опасных инфекций центров госсанэпиднадзора ведомственных и противочумных учреждений;
- порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности.
Порядок получения лабораториями разрешения на работу с микроорганизмами I - IV групп патогенности определяется действующими нормативными документами о порядке выдачи разрешений на эти виды работ.
Все диагностические лаборатории, выполняющие работы с микроорганизмами I - IV групп патогенности, должны иметь лицензию на деятельность, связанную с использованием возбудителей инфекционных заболеваний.
В условиях осложнения эпидемиологической обстановки временное разрешение на проведение диагностических исследований на холеру бактериологическим лабораториям центров госсанэпиднадзора, включенным в состав лабораторной службы очага, в случае расширения их функциональных обязанностей, предоставляется решением медицинского штаба очага.
4.1. При осуществлении эпидемиологического надзора
4.1.1. Бактериологические лаборатории центров госсанэпиднадзора в городах и районах, учреждений лечебно-профилактических и ведомственных служб:
- проводят плановые диагностические исследования на холеру материала от больных острыми кишечными инфекциями, определенного контингента здоровых лиц и проб из объектов окружающей среды в объеме, предусмотренном для соответствующего типа территорий по эпидпроявлениям холеры. Исследования ведут до установления отрицательного результата анализа или до выделения культуры с характерным для вибрионов ростом на агаровой и полиуглеводной средах и положительной реакцией на оксидазу. Культуры проверяют на чистоту в мазке, окрашенном по Граму, на подвижность и в реакции агглютинации на стекле (далее - слайд-агглютинации) с холерными сыворотками O1, Огава, Инаба, РО и O139.
При положительном результате слайд-агглютинации немедленно сообщают в территориальный центр госсанэпиднадзора, культуру для окончательной идентификации немедленно доставляют в специализированную лабораторию в установленном порядке.
При отрицательном результате слайд-агглютинации:
- культуру, выделенную от людей, направляют для дальнейшей идентификации в специализированную лабораторию;
- неагглютинирующиеся культуры, выделенные из объектов окружающей среды, идентифицируют на месте или по согласованию передают в территориальный центр госсанэпиднадзора.
4.1.2. Лаборатории особо опасных инфекций центров госсанэпиднадзора в республиках, краях, областях, городах и ведомственных учреждений:
- выполняют диагностическое исследование материала от больных и умерших с подозрением на холеру и проб из объектов окружающей среды;
- идентифицируют культуры вибрионов, выделенных в территориальных и ведомственных лабораториях, определяя их таксономическую принадлежность, а также определяют эпидемическую значимость (токсигенность) и антибиотикочувствительность холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп по регламентированным для лабораторий тестам;
- осуществляют (или организуют) бактериологический контроль качества питательных сред и других диагностических препаратов, используемых в территориальных лабораториях;
- представляют оперативную информацию о выделении культур холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп;
- в установленном порядке немедленно передают в территориальное противочумное учреждение культуры холерных вибрионов, таксономическая принадлежность или токсигенность которых имеющимися средствами диагностики не определяется;
- в течение 5 дней после окончания идентификации передают в территориальное противочумное учреждение или головной по проблеме "Холера" противочумный институт все культуры холерных вибрионов O1, O139, независимо от объекта обследования, и других серогрупп при выделении от больных;
- контролируют деятельность территориальных лабораторий, оказывают им методическую помощь по всем вопросам лабораторного обеспечения эпидемиологического надзора за холерой.
4.1.3. Лаборатории противочумных учреждений:
- проводят исследования материала от больных и умерших с подозрением на заболевание холерой, а также проб из объектов окружающей среды;
- подтверждают таксономическую принадлежность культур холерных вибрионов, выделенных на курируемой территории;
- идентифицируют все атипичные культуры холерных вибрионов с использованием дополнительных методов серологической, биохимической и других видов идентификации с целью уточнения таксономической принадлежности;
- определяют эпидемическую значимость (токсигенность) и антибиотикочувствительность культур;
- осуществляют методическое руководство по всем вопросам лабораторного обеспечения эпидемиологического надзора за холерой на курируемой территории;
- в установленном порядке передают с паспортами выделенные культуры холерных вибрионов в территориальный противочумный институт, в головной по проблеме "Холера" - Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт. Кроме того, паспорта на эти же культуры направляют в Противочумный центр Минздрава России.
Лабораторное обеспечение эпидемиологического надзора за холерой осуществляют в соответствии с планом противохолерных мероприятий, действующими нормативными и методическими документами. Профилактические исследования на холеру проводят в пределах рабочего дня с использованием соответствующих питательных сред, диагностические исследования материала от подозрительных на холеру больных (трупов) - в условиях круглосуточного режима работы лаборатории.
4.2. При проведении противоэпидемических мероприятий
Организация и регламентирование деятельности лабораторий, а также формирование лабораторной службы в очаге холеры осуществляется в соответствии с действующими методическими указаниями по вопросам профилактики холеры, организации мероприятий и оценки противоэпидемической готовности медицинских учреждений к проведению мероприятий на случай возникновения очага холеры.
5. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
В системе противохолерных мероприятий значительное место занимает бактериологический анализ, от правильности и своевременности проведения которого зависит характер и объем профилактических и противоэпидемических мероприятий.
Исследования проводят с целью:
- выявления больных холерой и вибриононосителей;
- установления окончательного диагноза при вскрытии трупов лиц, умерших от подозрительного на холеру заболевания;
- обоснования выбора средств этиотропной терапии холеры;
- бактериологического контроля эффективности лечения больных холерой и вибриононосителей;
- бактериологического контроля объектов окружающей среды, в т.ч. поверхностных водоемов;
- бактериологического контроля эффективности обеззараживания в очаге инфекции.
5.1. Отбор и доставка материала на исследование
Материалом для бактериологического анализа могут служить испражнения, рвотные массы, желчь, трупный материал (отрезки тонкого кишечника и желчный пузырь); предметы, загрязненные испражнениями (постельное и нательное белье и др.); вода, ил, гидробионты, сточные воды, содержимое выгребных туалетов; смывы с объектов окружающей среды, пищевые продукты, мухи и др.
Материал от больного забирает медицинский персонал лечебного учреждения немедленно после выявления больного и до начала лечения антибиотиками. Руководитель несет ответственность за правильность отбора, хранения и доставки проб в лабораторию.
Необходимо учитывать высокую чувствительность холерных
вибрионов к дезинфицирующим средствам и кислотам, возможность
антагонистического действия сопутствующей микрофлоры и
предполагаемую концентрацию возбудителя в исследуемом материале.
Если в материале от больных алгидной формой холеры концентрация
6 9
возбудителя достигает 10 - 10 м.к./мл, то в испражнениях больных
легкой формой и леченных антибиотиками, реконвалесцентов
и носителей количество холерных вибрионов обычно не превышает
2 4
10 - 10 м.к./г.
Для отбора проб используют чистую стерильную посуду, не содержащую следов дезинфицирующих растворов. Стерилизацию посуды и других средств забора материала проводят автоклавированием, сухим жаром или кипячением в 2-процентном растворе пищевой соды.
Материал для исследования должен быть доставлен не позже чем через 2 ч после его взятия. В случае удлинения сроков доставки используют транспортные среды. Наиболее удобной и достаточно эффективной является 1-процентная пептонная вода (рН 8,4 +/- 0,1).
В пептонную воду в качестве ингибитора сопутствующей флоры может быть добавлен теллурит калия из расчета 1:100000 - 1:200000 или моющее средство "Прогресс" в концентрации 0,1 - 0,2%. В отдельных случаях для транспортирования материала могут быть использованы солевые консерванты (см. раздел 7).
На флаконах (пробирках) с пептонной водой, передаваемых в стационары для отбора проб, должна быть этикетка или надпись с указанием названия среды и даты ее приготовления.
Среды во флаконах или пробирках, закрытых ватно-марлевыми пробками, рекомендуется хранить не более 2 суток при температуре не выше (10,0 +/- 0,2) °C при условии сохранения их стерильности. Целесообразно обеспечение стационаров и групп забора проб средами в закатанных флаконах.
При наличии у больного диареи материал забирают до начала этиотропной терапии в количестве 10 - 20 мл, у больных легкими формами - 1 - 2 г испражнений. От больных тяжелой формой материал направляют в лабораторию нативным и в 1-процентной пептонной воде. В транспортную среду вносят 1 - 2 мл или 1 - 2 г материала на 5 - 6 мл среды.
При вынужденном удлинении сроков доставки материала в лабораторию (длительное плавание, круиз и т.п.) можно использовать полоски фильтровальной (промокательной) бумаги. Жидкими испражнениями пропитывают полоску обычной плотной промокательной бумаги или другого гигроскопичного материала и герметично упаковывают в пластиковый пакет для предохранения от высыхания при транспортировании в лабораторию. На таких полосках холерные вибрионы выживают до четырех-пяти или более недель, пока сохраняется влага.
При обследовании на вибриононосительство материал забирает медицинский персонал лечебно-профилактических учреждений, в очаге - создают специальные группы по отбору проб, работающие под руководством эпидемиологов.
Материал в количестве 1 - 2 г может быть доставлен на исследование нативным, в 1-процентной пептонной воде или другой транспортной среде.
5.1.1. Способы отбора проб от больных холерой, вибриононосителей и контактных с ними лиц, секционного материала.
Испражнения и рвотные массы в количестве 10 - 20 мл собирают в стерильную посуду стерильными ложками или стеклянными трубками с резиновой грушей из индивидуального судна, на дно которого помещают меньший по размеру сосуд (лоток), удобный для обеззараживания кипячением.
Для взятия материала у больных с обильным водянистым стулом можно использовать резиновый катетер, один конец которого вводят в прямую кишку, а другой опускают в банку. Жидкие испражнения стекают в сосуд свободно или при легком массаже брюшной стенки.
Стерильный ректальный ватный тампон из гигроскопической ваты вводят в прямую кишку на глубину 5 - 6 см и собирают им содержимое со стенок кишечника. Тампон опускают во флакон или пробирку с 1-процентной пептонной водой, обломив часть деревянного стержня.
Стандартную стерильную петлю из алюминиевой проволоки перед забором материала смачивают стерильным 0,9-процентным раствором натрия хлорида и вводят в прямую кишку на 8 - 10 см. Взятый материал переносят во флакон или пробирку с 1-процентной пептонной водой.
Желчь берут при дуоденальном зондировании в лечебном учреждении. В отдельные пробирки собирают две порции: из желчного пузыря и желчных протоков (В и С). Материал доставляют нативным.
От умерших с подозрением на холеру берут отрезки (длиной около 10 см) верхней, средней и нижней частей тонкой кишки, разрез производят между двойными лигатурами, предварительно наложенными на оба конца изымаемого участка кишечника. Желчный пузырь после перевязки протока извлекают целиком. Содержимое кишечника и желчь от трупа можно взять стерильным шприцем с толстой иглой в объеме до 10 мл и перенести в емкость с 1-процентной пептонной водой. Взятые образцы органов трупа укладывают раздельно в стерильные банки.
Банки, пробирки с материалом закрывают непромокаемыми пробками и пергаментной бумагой, тщательно обрабатывают снаружи салфеткой, смоченной дезинфицирующим раствором, избегая затекания его внутрь. Все пробы этикетируют, укладывают в специально подготовленную для транспортирования металлическую тару и перевозят на служебном транспорте с сопровождающим. Форма направления дана в Приложении 1.
5.1.2. Отбор проб из объектов окружающей среды.
Воду (питьевую, из поверхностных водоемов и др.) для исследования берут в количестве 1 л на одну пробу в двух объемах по 500 мл в стерильную посуду с непромокаемой пробкой.
Из водопроводных кранов пробы воды берут после предварительного обжигания их спиртовым факелом и спуска воды в течение 10 мин. при полном открытии крана.
Хозяйственно-бытовые сточные воды отбирают для исследования двумя способами: в объеме 1 л также в двух емкостях по 500 мл или тампонами, приготовленными из марлевых салфеток размером 10 x 10 см, сложенных в 10 - 15 слоев. Последние закрепляют у места забора воды, через сутки помещают в стерильную банку и доставляют в лабораторию.
Гидробионтов (рыб, лягушек и др.) отлавливают из водоемов любым способом и в закрытых банках, ведрах и других сосудах доставляют в лабораторию.
Исследовать зоопланктон (дафнии, циклопы и др.) можно групповым методом, объединяя в один посев 10 - 30 образцов, отловленных на одном участке водоема. В этом случае они могут быть доставлены в одном сосуде. При исследовании рыб берут содержимое желудка и жабры.
Смывы с различных объектов окружающей среды берут ватным или марлевым тампоном, смоченным 0,9-процентным раствором натрия хлорида, с поверхности площадью 10 x 10 см. Тампон опускают во флакон или пробирку с 1-процентной пептонной водой.
Для сбора мух расставляют мухоловки, в которые наливают 1-процентную пептонную воду с 1% сахара.
Остатки пищи в очаге и по показаниям пищевые продукты отбирают по 200 г плотных и 0,5 л жидких, помещают в стеклянную посуду и закрывают. При необходимости в жидкие продукты добавляют основной пептон до 1-процентной концентрации.
Пробы объектов окружающей среды этикетируют, заполняют направление (Приложение 2) и отправляют в лабораторию с нарочным согласно действующим СП.
Перечень предметов, входящих в укладки для отбора проб, см. в Приложениях 3, 4.
5.2. Порядок исследования
При бактериологическом исследовании на холеру используют различные питательные среды: жидкие среды обогащения, щелочной агар, элективные дифференциально-диагностические среды и набор сред для идентификации.
Применяют сухие среды производственного выпуска, имеющие номера госрегистрации и лицензии, или среды, консерванты, приготовленные по рецептуре и технологии, изложенной в разделе 7. Перечень производственных питательных сред и диагностических препаратов для выделения и идентификации возбудителя холеры приведен в Приложении 5. При транспортировании и хранении медицинских иммунобиологических препаратов следует руководствоваться СП 3.3.2.028-95. Используемые для диагностики холеры питательные среды подлежат бактериологическому контролю в установленном порядке.
Агаровые среды перед использованием должны быть тщательно подсушены. Посев делают так, чтобы получить рост в виде изолированных колоний. Все посевы инкубируют при температуре (37,0 +/- 0,5) °C.
Посевы исследуемого материала на всех этапах выращивают в 1-процентной пептонной воде 6 - 8 ч, в пептонной воде с теллуритом калия - 12 - 18 ч, на щелочном агаре - не менее 14 - 16 ч, а на плотных элективных средах - 18 - 24 ч. Теллурит калия следует добавлять в 1-процентную пептонную воду с рН не ниже 8,3 +/- 0,1, до внесения исследуемого материала. Продолжительность хранения рабочего раствора теллурита калия (1:1000) - 7 дней, а питательных сред с теллуритом калия - не более 2 суток при условии содержания их в холодильнике.
5.2.1. Исследование проб от больных и вибриононосителей, секционного материала (рис. 1).
-----------------------------------------------------------------¬
¦ Исследуемый материал ¦
L------T---------T-------------------------------------T----------
¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦
/ / /
-------¬ ----T------------------------>--------------------¬
¦ЩА, ЭС¦ ¦ I ¦ -----¬ ¦Ускоренные методы: ¦
L--T---- L-T-+------->¦ II +---------->¦- МФА ¦
¦ ¦ L-T--- ¦- РИВ ¦
¦ / ¦ ¦- РНГА ¦
¦ -------¬ / ¦- ПЦР ¦
¦ ¦ЩА, ЭС¦ -----¬ L--------------------
¦ L---T--- ¦ ЩА ¦
¦ ¦ L-T---
¦ ¦ ¦
/ / /
--------------------------------------¬
¦- отбор колоний ¦
¦- высев подозрительных колоний на ЩА ¦
¦и ПУС ¦
L-------------------------------T------
¦
/
---------------------------¬
¦Отбор культур по ПУС и ОП ¦
L--------------------T------
¦
/
-----------T-----------T---------T-------------T------------¬
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
/ / / / / /
-----¬ ------¬ ------¬ -----¬ -----¬ -----¬
¦ПУС+¦ ¦ПУС+*¦ ¦ОП+* ¦ ¦ПУС-¦ ¦ПУС-¦ ¦ПУС+¦
¦ОП+ ¦ L------ L------ ¦ОП+ ¦ ¦ОП- ¦ ¦ОП- ¦
L-T--- L--T-- L-T--- L-T---
¦ ¦ ¦ ¦
L---------------T------------------ / /
¦ --------¬ -------¬
/ ¦Не ис- ¦ ¦Иссле-¦
------------------------------¬ ¦следуют¦ ¦дуют ¦
---+ ОРА с сыворотками O1 и O139 +---------¬ L-------- ¦на ки-¦
¦+ L------------------------------ - ¦ ¦шечную¦
¦ ¦ ¦группу¦
¦ ¦ L-------
¦ ¦
/ /
--------------------------------------¬ -----------------------¬
¦Сокращенная схема идентификации: ¦ ¦Определение ¦
¦- морфология и подвижность микробных ¦ ¦принадлежности к роду ¦
¦клеток ¦ ¦Vibrio, виду ¦
¦- ОП ¦ ¦V. cholerae или другим¦
¦- O/F тест и отношение к отдельным ¦ ¦видам патогенных ¦
¦углеводам (табл. 4) ¦ ¦вибрионов ¦
¦- МФА ¦ L-----------------------
¦- РИВ ¦ -----------------------¬
¦- РА с сыворотками O1, Инаба, Огава, ¦ ¦Условные обозначения: ¦
¦РО или слайд-агглютинация с O139 ¦ ¦I и II - среда ¦
¦- чувствительность к фагам холерным ¦ ¦накопления; ЩА - ¦
¦классическому и эльтор ¦ ¦щелочной агар; ЭС - ¦
¦Дополнительные признаки биовара ¦ ¦элективная среда для ¦
¦V. cholerae: ¦ ¦выделения холерных ¦
¦- гемагглютинация ¦ ¦вибрионов; ПУС - ¦
¦- чувствительность к полимиксину В ¦ ¦полиуглеводная среда; ¦
¦50 ед./мл ¦ ¦ОП - оксидазная проба;¦
¦- реакция Фогес - Проскауэра ¦ ¦ОРА - ориентировочная ¦
¦Определение антибиотикограммы ¦ ¦реакция агглютинации; ¦
¦Оценка эпидемической значимости: ¦ ¦РА - развернутая реак-¦
¦- гемолитическая активность по Грейгу¦ ¦ция агглютинации; МФА ¦
¦- чувствительность к фагам холерным ¦ ¦- метод флюоресцирую- ¦
¦эльтор ctх+ и ctx- ¦ ¦щих антител; РИВ - ¦
¦- ПЦР, ДНК-зондирование ¦ ¦реакция иммобилизации ¦
¦- токсигенность на кроликах-сосунках ¦ ¦вибрионов; РНГА - ¦
¦Уточнение родовой и видовой ¦ ¦реакция непрямой ¦
¦принадлежности атипичных культур по ¦ ¦гемагглютинации; ПЦР -¦
¦расширенному набору признаков ¦ ¦полимеразная цепная ¦
¦(табл. 2, 3) ¦ ¦реакция; ¦
L-------------------------------------- ¦* - в случае отбора ¦
¦колоний только на ПУС ¦
¦или ЩА. ¦
L-----------------------
Рис. 1. Схема лабораторного исследования на холеру
I этап
Испражнения, рвотные массы больных, а также содержимое кишечника, желчного пузыря и суспензию кусочков слизистой тонкого кишечника трупа в объеме 0,5 - 1,0 мл засевают пипеткой в 50 - 100 мл накопительной среды, петлей - на щелочной агар и одну из элективных сред (СЭДХ, TCBS).
При исследовании материала от больных с подозрением на заболевание холерой не допускается использование 1-процентной пептонной воды с теллуритом калия в качестве накопительной среды.
В случае поступления материала от больных с подозрением на холеру целесообразно применять ускоренные методы исследования: иммунолюминесцентный, иммобилизацию и ПЦР со специфическими праймерами (см. раздел 6).
Материал от подозреваемых на вибриононосительство засевают в 50 мл среды накопления при индивидуальных анализах и в 100 мл - при групповых, объединяя в один флакон по 0,5 - 1,0 мл пробы не более чем от 5 человек. К групповым посевам прибегают в редких случаях при проведении массовых обследований на вибриононосительство.
Материал, доставленный в 5 мл 1-процентной пептонной воды, полностью используют для посева в 50 мл среды накопления. В случае поступления в лабораторию материала, забранного в 50 мл 1-процентной пептонной воды во флаконе, и доставки его не позже 2 ч после забора пробы флакон помещают в термостат на 6 ч для накопления возбудителя. При доставке материала в более поздние сроки 5 мл его засевают в 50 мл 1-процентной пептонной воды.
В отдельных случаях, при бактериологическом исследовании материала от лиц, принимавших антибиотики, активные по отношению к возбудителю холеры, его засевают в 200 - 300 мл 1-процентной пептонной воды (предпочтительно в широкогорлые колбы) и на 2 чашки щелочного агара так, чтобы получить рост в виде изолированных колоний. Посевы инкубируют при 37 °C в течение 24 ч, производя последовательные высевы через 8 - 10 ч инкубации с поверхностного слоя среды на пластинки щелочного агара. Использование второй среды обогащения в этом варианте исследования нецелесообразно.
II этап (через 6 - 8 ч от начала исследования)
С первой среды накопления делают высев на щелочной агар и одну из элективных сред и в 5 - 8 мл второй среды накопления. Пересевы в жидкие и на плотные среды делают с поверхности жидкой среды большой бактериологической петлей диаметром 5 мм.
При отрицательных результатах исследования нативного материала ускоренными методами их повторяют после 6 ч инкубации первой среды накопления.
III этап (через 12 - 16 ч от начала исследования)
Высев со второй среды накопления на щелочной агар.
В случае необходимости ускорения хода анализа материала от больного или подозрительного на заболевание холерой отбор колоний со щелочного агара, засеянного в начале исследования, можно начинать уже на этом этапе, в остальных случаях - на следующем.
IV этап (через 18 - 24 ч от начала исследования)
Отбор подозрительных на холерный вибрион колоний в посевах на плотные среды нативного материала, а также в высевах из 1-й и 2-й накопительных сред.
Чашки с посевами просматривают в проходящем свете невооруженным глазом или с помощью лупы, а также (особенно в вечернее и ночное время) под стереоскопическим микроскопом в косо проходящем свете и отбирают подозрительные на вибрионы колонии для выделения и идентификации культуры.
На щелочном агаре колонии холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп в типичной S-форме - круглые, гладкие, плоские, голубоватые, гомогенные, с ровными краями, прозрачные в проходящем свете и светло-серые с голубым или зеленоватым оттенком под стереоскопическим микроскопом в косо проходящем свете (Приложение 6).
Колонии холерных вибрионов на элективных средах TCBS и СЭДХ имеют ярко-желтую окраску на зеленом или синем фоне среды, полупрозрачные. Размеры колоний на щелочном агаре через 10 - 12 ч инкубации обычно не превышают 1 мм, а к 18 - 24 ч достигают 2 - 3 мм в диаметре. Темпы формирования колоний холерных вибрионов на элективных средах несколько замедлены, поэтому просмотр посевов на СЭДХ или TCBS следует проводить не ранее чем через 18 - 20 ч инкубации, когда размеры их становятся близки к колониям, вырастающим на щелочном агаре.
В отдельных случаях в посевах могут также встречаться атипичные колонии: мутные с плотным центром, пигментированные (коричневые или светло-желтые), мельчайшие коккоподобные, шероховатые.
Следует иметь в виду, что состав и качество питательных сред оказывают влияние на величину и плотность колоний холерных вибрионов, а также на морфологию клеток.
При отборе колоний можно использовать пробу на индофенолоксидазу с однокомпонентным реактивом (без альфа-нафтола) или с индикаторными бумажками из набора СИБ-1 для идентификации вибрионов. С колониями, обнаруженными на элективных средах, пробу на оксидазу ставить не рекомендуется.
Подозрительные колонии проверяют в слайд-агглютинации с сывороткой холерной O1 в разведении 1:50 - 1:100. При положительной реакции и достаточном количестве подозрительных колоний ставят слайд-агглютинацию с варианто-специфическими сыворотками Инаба и Огава в том же разведении, приготавливают мазки для окраски по Граму и обработки флюоресцирующими иммуноглобулинами. При отрицательных результатах колонии, обнаруженные в посевах материала от больных, проверяют в слайд-агглютинации с холерными сыворотками O139 и РО.
Положительная ориентировочная реакция агглютинации с холерной O1 сывороткой в разведении 1:100 и варианто-специфической в разведении 1:50 или положительная реакция с флюоресцирующими иммуноглобулинами в сочетании с морфологическими, культуральными признаками и специфической иммобилизацией позволяют выдать на соответствующем этапе предварительный ответ об обнаружении в исследуемом материале холерного вибриона O1, а в случае положительной реакции с сывороткой O139 - холерного вибриона O139 серогруппы.
Подозрительные на вибрионы колонии, агглютинирующиеся и не агглютинирующиеся холерными O1 и O139 сыворотками, отсевают на одну из полиуглеводных сред (лактозосахарозная, Ресселя, Клиглера, маннозосахарозная или др.) и (или) на сектор пластинки щелочного агара для выделения чистой культуры, ее идентификации и определения чувствительности к антибиотикам.
V этап (через 24 - 36 ч от начала исследования)
Отбор культур для идентификации.
На полиуглеводных средах отбирают культуры с типичными для вибрионов характером роста и изменениями:
- на двууглеводных средах (лактозосахарозная, глюкозолактозная и Клиглер) наблюдается характерное для кислой реакции изменение цвета столбика при сохранении цвета скошенной части без образования газа, а также сероводорода, улавливаемого в среде Клиглера;
- в маннозосахарозной среде за счет ферментации обоих углеводов окрашиваются и столбик, и скошенная часть, а также улавливается образование сероводорода.
Культуры, выросшие на щелочном агаре, проверяют на наличие индофенолоксидазы.
Определяют морфологию микроорганизмов и чистоту отобранных культур, выросших на щелочном агаре и полиуглеводных средах, с помощью окрашенных по Граму мазков.
Культуры, дающие характерные изменения на полиуглеводных средах и положительные в пробе на оксидазу, проверяют в ориентировочной слайд-агглютинации с холерными сыворотками O1 в разведении 1:100, РО, Инаба и Огава - в разведении 1:50. При отрицательных результатах с этими сыворотками ставят слайд-агглютинацию с холерной сывороткой O139 серогруппы, используя ее в соответствии с инструкцией по применению.
На основании положительных результатов агглютинации с сыворотками O1, Инаба или/и Огава выдают предварительный положительный ответ о выделении из исследуемого материала культуры холерного вибриона O1 соответствующего серовара.
Если выделенная культура реагирует с холерной сывороткой O139 при отрицательных результатах с сыворотками O1 серогруппы, выдают ответ о выделении холерного вибриона O139 серогруппы.
Проводят идентификацию выделенных на полиуглеводных средах или на щелочном агаре агглютинирующихся и не агглютинирующихся сыворотками O1, РО или O139 серогрупп оксидазопозитивных культур по сокращенной или полной схеме.
VI этап (через 36 - 48 ч от начала исследования)
Учитывают результаты идентификации и выдают окончательный ответ о выделении культуры холерного вибриона соответствующей серогруппы и биовара.
Для холерных вибрионов O1 эпидемическую значимость оценивают по тестам гемолитической активности и чувствительности к фагам эльтор ctx+ и ctx-, а в специализированных учреждениях - по результатам ПЦР или генетического зондирования на присутствие в геноме выделенной культуры ctx AB гена, а также токсигенности на модели кроликов-сосунков. Эпидемическую значимость холерных вибрионов O139 серогруппы определяют по тем же тестам, кроме чувствительности к фагам эльтор ctx+ и ctx-. К окончанию этого этапа исследования должна быть определена антибиотикочувствительность выделенной культуры.
При выделении от больного или вибриононосителя культуры холерного вибриона, не агглютинирующейся холерными сыворотками O1 и O139, выдают ответ о выделении холерных вибрионов не O1 и не O139. При наличии вибрионных агглютинирующих диагностических сывороток определяют принадлежность к другим серогруппам (О2 - О83).
Идентификацию культур, агглютинирующихся РО-сывороткой, см. в разделе 5.3.
5.2.2. Исследование объектов окружающей среды.
Схема анализа объектов окружающей среды отличается от схемы исследования материала от больных только на I этапе, II - VI этапы изложены выше.
Вода поверхностных водоемов и водопроводная
В зависимости от времени доставки пробы возможны следующие варианты посевов с целью первичного накопления вибрионов:
- к исследуемой воде добавляют раствор основного пептона до 1-процентной концентрации, определяют рН, в случае необходимости подщелачивают 10-процентным раствором едкого натрия до рН 8,4 +/- 0,1. Время инкубации в 1-й среде накопления - 8 - 10 ч. Объем 2 среды накопления - 10 мл; время инкубации в среде без теллурита калия 6 ч, а с теллуритом калия - 18 - 20 ч;
- в исследуемую воду добавляют раствор основного пептона до 1-процентной концентрации и теллурит калия из рабочего разведения 1:1000 до концентрации 1:100000 или 1:200000 в соответствии с данными проверки. Устанавливают рН - 8,4 +/- 0,1. Время инкубации 18 - 24 ч; вторая среда накопления - 10 мл среды без теллурита калия, время инкубации 6 - 8 ч;
- исследование проб воды можно также проводить с использованием в качестве ингибитора посторонней флоры моющего средства "Прогресс" в концентрации 0,1 - 0,2%;
- после добавления основного раствора пептона до 1-процентной концентрации и установления щелочной реакции пробы сохраняют при комнатной температуре (не выше 25 °C) до утра (первая среда накопления). В начале следующего дня засевают 5 мл поверхностного слоя в 100 мл 1-процентной пептонной воды (вторая среда накопления) и делают высев на щелочной агар; высев со второй среды накопления производят через 6 - 8 ч инкубации;
- воду фильтруют через мембранные фильтры N 2 или 3, смыв с которых сеют в накопительную среду и на агаровые пластинки. Из смыва с фильтра можно делать мазки для окраски флюоресцирующими холерными иммуноглобулинами, а также ставить РНГА, ПЦР со специфическими праймерами.
При интенсивном бактериальном загрязнении проб можно использовать 3 среду накопления.
Хозяйственно-бытовые сточные воды
Сточные воды, доставленные в объеме 1 л, фильтруют через бумажный или матерчатый фильтр для освобождения от механических примесей (при необходимости).
После добавления к пробам основного раствора пептона до 1-процентной концентрации устанавливают рН 8,4 +/- 0,1 и инкубируют в объемах по 500 мл 8 - 10 ч (1 среда накопления) или с добавлением теллурита калия 1:100000 (1:200000) - 18 - 24 ч.
При заборе сточных вод марлевыми тампонами последние помещают в широкогорлые колбы или банки с накопительной средой (500 мл) и далее исследуют, как указано выше.
Гидробионты
Лягушку непосредственно перед исследованием обездвиживают уколом иглы в спинной мозг и фиксируют на препаровальной доске брюшком вверх. Поверхность брюшка обрабатывают спиртом и ножницами делают медиальный разрез. Желчный пузырь отсекают от печени, разрезают и делают отпечаток на пластинке щелочного агара. Остатки желчи вместе с желчным пузырем помещают во флаконы с 50 - 100 мл 1-процентной пептонной воды. Содержимое желудка засевают в 1-процентную пептонную воду, а внутренней поверхностью стенки делают отпечатки на агаровые пластинки. Посев кишечника делают таким же образом, отсекая несколько петель в верхнем, среднем и нижнем отделах кишечника.
У крупных рыб в том же порядке засевают в накопительную среду содержимое желчного пузыря, желудка, кишечника и жабры. Мелких рыб (мальков) измельчают ножницами по 10 - 20 экз. в одной пробе и делают посев суспензии петлей на чашку с агаром и в 1-процентную пептонную воду.
Дафний, циклопов и др. рачков растирают в ступке и засевают петлей в 1-процентную пептонную воду.
У раков исследуют кишечник и жабры, делая посев содержимого в среду накопления, и слизистой стенки - отпечатком на агаровую среду.
Пищевые продукты
Безалкогольные напитки исследуют тем же методом, что и воду.
Молоко в количестве 5 мл сеют в 50 - 100 мл среды накопления или к 0,5 л молока добавляют основной раствор пептона до 1-процентной концентрации его в молоке. Другие молочные продукты (кефир, сметану, творог, мороженое и т.д.) в количестве 5 - 10 мл засевают в 1-процентную пептонную воду.
Твердые пищевые продукты измельчают, растирают в ступке с физиологическим раствором и засевают в количестве 10 г в 100 мл накопительной среды и петлей на агаровые среды.
Масло засевают в жидкую среду накопления в количестве 5 - 10 г, размягчив его в термостате, или делают посев смыва с поверхности его кусков.
После посева продукта устанавливают рН среды 8,4 +/- 0,1.
Смывы с объектов внешней среды и мух засевают в 1-процентную пептонную воду и исследуют по обычной схеме.
5.2.3. Порядок исследования в условиях односменной работы лаборатории.
При осуществлении эпиднадзора за холерой исследование материала от обследуемых контингентов может выполняться в следующих вариантах.
В качестве 1-й или 2-й среды накопления используют 1-процентную пептонную воду (рН 8,4 +/- 0,1) с теллуритом калия в конечной концентрации 1:100000 - 1:200000 в соответствии с результатами его контроля.
Вопрос выбора транспортной среды и порядка исследования решают в зависимости от разницы времени с момента взятия пробы до поступления ее в лабораторию. Примерная схема забора материала от больных в 1-процентную пептонную воду и порядок дальнейшего его исследования на холеру с учетом различного времени доставки в лабораторию представлены в табл. 1. В течение рабочей недели для отбора проб используют 1-процентную пептонную воду без теллурита калия в объеме 5 - 10 мл, во флаконах или пробирках (транспортная среда).
Таблица 1
ПОРЯДОК ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛА В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВРЕМЕНИ
ОТБОРА И ДОСТАВКИ ЕГО В ЛАБОРАТОРИЮ В 1% ПВ
------T------------T-----------T---------T----------T------------T---------------------T----------¬
¦N ¦Время взятия¦ Время ¦Среда для¦Назначение¦ 1-я среда ¦2-я среда накопления.¦ Высев со ¦
¦вари-¦ материала ¦доставки в ¦ взятия ¦ среды ¦ накопления ¦ Высев с 1-й среды ¦2-й среды ¦
¦антов¦ ¦лабораторию¦ проб ¦ ¦ ¦ накопления ¦накопления¦
+-----+------------+-----------+---------+----------+------------+---------------------+----------+
¦1 ¦6.00 - 10.00¦До 10.00 ¦а) 1% ПВ ¦Среда ¦Среда с ¦Через 6 ч инкубации ¦В начале ¦
¦ ¦ ¦ ¦50 мл ¦накопления¦доставленным¦пересев в 1% ПВ с ТК ¦следующего¦
¦ ¦ ¦ ¦б) 1% ПВ ¦Транспорт-¦материалом ¦и высев на щелочной ¦рабочего ¦
¦ ¦ ¦ ¦5 - 10 мл¦ная среда ¦Посев в ¦агар и (или) ЭС ¦дня ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦50 мл 1% ПВ ¦ ¦ ¦
+-----+------------+-----------+---------+----------+------------+---------------------+----------+
¦2 ¦10.00 - ¦После 10.00¦1% ПВ ¦Транспорт-¦Посев 5 - 10¦9.00 следующего дня ¦Через 6 ¦
¦ ¦до конца ¦в течение ¦5 - 10 мл¦ная среда ¦мл среды с ¦пересев в 1% ПВ, ¦часов ¦
¦ ¦рабочего дня¦рабочего ¦ ¦ ¦материалом в¦высев на щелочной ¦инкубации ¦
¦ ¦лаборатории ¦дня ¦ ¦ ¦50 мл 1% ПВ ¦агар и (или) ЭС ¦ ¦
¦ ¦ ¦лаборатории¦ ¦ ¦с ТК ¦ ¦ ¦
+-----+------------+-----------+---------+----------+------------+---------------------+----------+
¦3 ¦По окончании¦До 10.00 ¦1% ПВ ¦Транспорт-¦Посев 5 - 10¦Через 6 ч инкубации ¦В начале ¦
¦ ¦рабочего дня¦следующего ¦5 - 10 мл¦ная среда ¦мл среды с ¦пересев в 1% ПВ с ТК,¦следующего¦
¦ ¦лаборатории ¦дня ¦ ¦ ¦материалом в¦высев на щелочной ¦рабочего ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦50 мл 1% ПВ ¦агар и (или) ЭС ¦дня ¦
+-----+------------+-----------+---------+----------+------------+---------------------+----------+
¦4 ¦Выходные дни¦До 10.00 ¦1% ПВ с ¦Транспорт-¦Посев 5 - 10¦Через 6 ч инкубации ¦В начале ¦
¦ ¦лаборатории ¦рабочего ¦ТК 50 мл ¦ная среда ¦мл среды с ¦пересев в 1% ПВ с ТК,¦следующего¦
¦ ¦ ¦дня ¦ ¦ ¦материалом ¦высев на щелочной ¦рабочего ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦в 50 мл 1% ¦агар и (или) ЭС ¦дня ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ПВ ¦ ¦ ¦
+-----+------------+-----------+---------+----------+------------+---------------------+----------+
¦Обозначения: ТК - теллурит калия; ПВ - пептонная вода; ¦
¦ЭС - элективная среда для выделения холерного вибриона ¦
L--------------------------------------------------------------------------------------------------
Пробы до отправки в лабораторию сохраняют при комнатной температуре (24,0 +/- 1,0) °C в биксах, ящике, шкафу и т.д. в специально выделенной комнате, закрывающейся на замок. Продолжительность сохранения проб в указанных условиях - до 24 ч.
В случаях, когда температура в помещении превышает 25 °C, материал следует брать в 1-процентную пептонную воду с теллуритом калия.
В лаборатории в пробы во флаконах доливают соответствующую среду накопления в количестве до 50 мл, а из пробирок все 5 - 10 мл транспортной среды с материалом переносят пипеткой в 50 мл среды накопления.
На период выходного дня лаборатории в порядке исключения допускается следующий вариант: забор материала в 50 мл 1-процентной пептонной воды с теллуритом калия (транспортная среда); допускаемое время сохранения проб до начала исследования при температуре (20,0 +/- 1,0) °C - 60 ч, (27,0 +/- 3,0) °C - 48 ч. В лаборатории 5 - 10 мл поверхностного слоя среды с материалом переносят в 50 мл 1-процентной пептонной воды без теллурита калия (1 среда накопления) и делают высев на чашку щелочного агара с дальнейшим исследованием по изложенной схеме.
Пептонную воду повышенной щелочности в качестве накопительной среды рекомендуется использовать только на первом этапе исследования с удлинением срока инкубации ее до 18 - 24 ч. Основной раствор пептона и 1-процентную пептонную воду с рН 9,5 +/- 0,5 можно готовить впрок по общепринятой методике с подщелачиванием до необходимого уровня и последующей стерилизацией при температуре 120 °C - 20 мин.
Для подщелачивания пептонной воды используют 10 - 20% NaOH.
5.3. Идентификация культур холерных вибрионов
Культуры, выделенные на различных этапах, идентифицируют с целью определения их принадлежности к виду Vibrio cholerae соответствующей серогруппы (O1, O139 или др.).
К виду V. cholerae относят грамотрицательные, аспорогенные, полиморфные палочки, слегка изогнутые или прямые, активно подвижные, с одним полярно расположенным жгутиком, образующие индофенолоксидазу, ферментирующие глюкозу в аэробных и анаэробных условиях до кислоты (без газа), расщепляющие маннит, маннозу, сахарозу, но не активные в отношении к арабинозе, инозиту, салицину и некоторым другим субстратам. Холерные вибрионы декарбоксилируют лизин и орнитин, но не обладают дигидролазой аргинина, образуют индол, обладают нитратредуктазой, не продуцируют сероводород. Таксономическое положение холерных вибрионов и признаки, дифференцирующие их от родственных микроорганизмов, приведены на рис. 2 и в табл. 2, 3, 4.
-----------------------¬
¦Семейство Vibrionaceae¦
¦Shewan and Veron, 1965¦
L----------TT-----------
¦L-------------------¬
/ ¦
-----------------------¬ ¦
¦ Типовой род Vibrio ¦ ¦
¦ Pacini, 1854 ¦ ¦
L-------T--T------------ /
--------------------¬ ¦ ¦ ---------------------¬
¦36 видов вибрионов,¦<------ ¦ ¦Другие роды: ¦
¦в т.ч. патогенных ¦ / ¦Aeromonas Kluyver et¦
¦для человека: ¦ ----------------¬ ¦Van Niel, 1936; ¦
¦V. alginolyticus ¦ ¦ Типовой вид ¦ ¦Enhydrobacter Staley¦
¦V. cincinnatiensis ¦ ¦Vibrio cholerae¦ ¦et al, l987; ¦
¦V. damsela <**> ¦ L------T--------- ¦Photobacterium ¦
¦V. fluvialis ¦ ¦ ¦Beijerinc, 1889; ¦
¦V. furnissii ¦ ¦ ¦Plesiomonas Habs et ¦
¦V. harveyi ¦ / ¦Schubert, 1962 ¦
¦V. hollisae ¦ ----------------¬ L---------------------
¦V. metschnikovii ¦ ¦ Серогруппы ¦
¦V. mimicus ¦ L---T--T--T------
¦V. parahaemolyticus¦ ¦ ¦ ¦
¦V. vulnificus ¦ ¦ ¦ ¦
L-------------------- ¦ ¦ ¦
--------------- / L-------¬
--------¬ ¦ --------¬ ¦ --------¬
¦ O1 ¦<- ¦ O139 ¦ L>¦ non ¦
¦ +------T-------+ ¦ ¦O1/O139¦
L---T---- ¦ L-------- L---T----
¦ / ¦
¦ Возбудители холеры Возбудители ¦ гастроэнтеритов
¦ и системных ¦ инфекций
/ /
-----------------¬ -----------------------¬
¦ Биовары ¦ ¦V. cholerae O2 - O138,¦
L------T-T-------- ¦O140 - O190... ¦
----- L----------¬ ¦(по международной ¦
¦ ¦ ¦классификации) ¦
/ / ¦V. cholerae O2 - O83 ¦
V. cholerae V. cholerae ¦(по отечественной ¦
cholerae eltor ¦классификации) <***> ¦
¦ ¦ L-----------------------
L--¬ ------
/ /
-----------------¬
¦ Серовары: ¦
¦ Inaba ¦
¦ Ogava ¦
¦ Hikojima ¦
L-----------------
Рис. 2. Классификация вибрионов <*>
------------------------------------
<*> Таксономия вибрионов представлена по Bergeys manual of Determinative Bacteriology, 1994.
<**> Предложено McDonell & Colwell (1985) отнести к новому роду Listonella.
<***> Типовые штаммы О2 - О39 соответствуют Sakazaki (1970); О40 - О83, а также O12; О23 и О26 не изучены в сравнении с международной коллекцией типовых штаммов.
Таблица 2
ОСНОВНЫЕ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ ПРИЗНАКИ РОДА VIBRIO
И НЕКОТОРЫХ ДРУГИХ МИКРООРГАНИЗМОВ
-----------------T------------------------------------------T-------T-------¬
¦ Признаки ¦ Роды сем. Vibrionaceae ¦Entero-¦Pseudo-¦
¦ +--------------T-----T------T-------T------+bacte- ¦monada-¦
¦ ¦ Vibrio ¦Aero-¦Enhy- ¦Plesio-¦Photo-¦riaceae¦ceae ¦
¦ +-------T------+monas¦dro- ¦monas ¦bacte-¦ ¦ ¦
¦ ¦V. cho-¦другие¦ ¦bacter¦ ¦rium ¦ ¦ ¦
¦ ¦lerae ¦ виды ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+----------------+-------+------+-----+------+-------+------+-------+-------+
¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9 ¦
+----------------+-------+------+-----+------+-------+------+-------+-------+
¦Окраска по ¦ Грамотрицательные ¦
¦Граму, ¦ полиморфные прямые или слегка изогнутые палочки ¦
¦морфология ¦ ¦
¦ +-------T------T-----T------T-------T------T-------T-------+
¦Подвижность ¦+ ¦+(-) ¦+(-) ¦- ¦+ ¦+ ¦+(-) ¦+ ¦
+----------------+-------+------+-----+------+-------+------+-------+-------+
¦Оксидаза ¦+ ¦+(-) ¦+ ¦+ ¦+ ¦+(-) ¦- ¦+(-) ¦
+----------------+-------+------+-----+------+-------+------+-------+-------+
¦Рост на средах ¦+ ¦-(+) ¦+ ¦+ ¦+ ¦- ¦- ¦- ¦
¦без NaCl ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+----------------+-------+------+-----+------+-------+------+-------+-------+
¦Чувствительность¦+ ¦+(-) ¦- ¦- ¦+ ¦+ ¦- ¦- ¦
¦к О129 <*> ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+----------------+-------+------+-----+------+-------+------+-------+-------+
¦О/Ф глюкозы ¦+/+ ¦+/+ ¦+/+ ¦+/+ ¦+/+ ¦+/+ ¦+/+ ¦+/- ¦
¦в среде ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Хью - Лейфсона ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+----------------+-------+------+-----+------+-------+------+-------+-------+
¦Газ из глюкозы ¦- ¦-(+) ¦+(-) ¦- ¦- ¦+ ¦+/- ¦- ¦
+----------------+-------+------+-----+------+-------+------+-------+-------+
¦Лизиндекарбок- ¦+ ¦+(-) ¦-(+) ¦+ ¦+ ¦+ ¦+/- ¦-(+) ¦
¦силаза ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+----------------+-------+------+-----+------+-------+------+-------+-------+
¦Орнитиндекар- ¦+ ¦+/- ¦-(+) ¦+ ¦+ ¦+ ¦+/- ¦-(+) ¦
¦боксилаза ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+----------------+-------+------+-----+------+-------+------+-------+-------+
¦Аргининдигид- ¦- ¦-(+) ¦+ ¦+ ¦+ ¦+ ¦-/+ ¦+/- ¦
¦ролаза ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+----------------+-------+------+-----+------+-------+------+-------+-------+
¦Ферментация: ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦лактозы ¦- ¦-(+) ¦-(+) ¦- ¦+ ¦X ¦+/- ¦-(+) ¦
+----------------+-------+------+-----+------+-------+------+-------+-------+
¦маннита ¦+ ¦+(-) ¦+(-) ¦X ¦- ¦- ¦+(-) ¦+(-) ¦
+----------------+-------+------+-----+------+-------+------+-------+-------+
¦арабинозы ¦- ¦-(+) ¦+(-) ¦X ¦- ¦- ¦+(-) ¦-(+) ¦
+----------------+-------+------+-----+------+-------+------+-------+-------+
¦сахарозы ¦+ ¦+(-) ¦+ ¦X ¦- ¦-(+) ¦ +/- ¦- ¦
+----------------+-------+------+-----+------+-------+------+-------+-------+
¦инозита ¦- ¦-(+) ¦- ¦X ¦+ ¦- ¦-(+) ¦X ¦
+----------------+-------+------+-----+------+-------+------+-------+-------+
¦Образование: ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ацетилметилкар- ¦+(-) ¦-(+) ¦+(-) ¦- ¦- ¦+ ¦-(+) ¦X ¦
¦бинола ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+----------------+-------+------+-----+------+-------+------+-------+-------+
¦индола ¦+ ¦+(-) ¦+(-) ¦- ¦- ¦- ¦+(-) ¦+/- ¦
+----------------+-------+------+-----+------+-------+------+-------+-------+
¦нитратредуктазы ¦+ ¦+(-) ¦+ ¦+ ¦+ ¦+(-) ¦+ ¦+/- ¦
+----------------+-------+------+-----+------+-------+------+-------+-------+
¦бета-галактози- ¦+ ¦+(-) ¦+ ¦X ¦+ ¦+ ¦-(+) ¦X ¦
¦дазы ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+----------------+-------+------+-----+------+-------+------+-------+-------+
¦желатиназы ¦+ ¦+(-) ¦+ ¦X ¦- ¦+ ¦-(+) ¦+/- ¦
+----------------+-------+------+-----+------+-------+------+-------+-------+
¦Биолюминесценция¦-(+) ¦-(+) ¦- ¦X ¦- ¦+ ¦- ¦- ¦
+----------------+-------+------+-----+------+-------+------+-------+-------+
¦Мол. % G + C ¦38 ¦51 ¦57 - ¦66 ¦51 ¦40 - ¦39 - 59¦58 - 70¦
¦в ДНК ¦ ¦ ¦63 ¦ ¦ ¦44 ¦ ¦ ¦
L----------------+-------+------+-----+------+-------+------+-------+--------
------------------------------------
<*> Бактериостатический агент 2,4-диамино-6,7-диизопропилптериоидин.
Условные обозначения:
Х - нет данных;
+ - положительный результат в 90%;
- - отрицательный результат в 90%;
+/- - положительный и отрицательный результаты встречаются в равной степени;
+(-) или -(+) - в скобках редко наблюдаемый результат.
Таблица 3
ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПАТОГЕННЫХ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА ВИДОВ
РОДА VIBRIO
---------------T-----T------T------T----T----T----T----T-----T------T-----T------T-----¬
¦ Признаки ¦V. ¦V. al-¦V. ci-¦V. ¦V. ¦V. ¦V. ¦V. ¦V. ¦V. ¦V. pa-¦V. ¦
¦ ¦cho- ¦gino- ¦cinna-¦dam-¦flu-¦fur-¦har-¦hol- ¦met- ¦mimi-¦rahae-¦vul- ¦
¦ ¦lerae¦lyti- ¦tien- ¦sela¦via-¦nis-¦veyi¦lisae¦schni-¦cus ¦moly- ¦nifi-¦
¦ ¦ ¦cus ¦sis ¦ ¦lis ¦sii ¦ ¦ ¦kovii ¦ ¦ticus ¦cus ¦
+--------------+-----+------+------+----+----+----+----+-----+------+-----+------+-----+
¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9 ¦ 10 ¦ 11 ¦ 12 ¦ 13 ¦
+--------------+-----+------+------+----+----+----+----+-----+------+-----+------+-----+
¦Морфология <*>¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦Подвижность ¦ + ¦ + ¦ + ¦ d ¦ d ¦ + ¦ - ¦ +/- ¦ d ¦ + ¦ + ¦ + ¦
+--------------+-----+------+------+----+----+----+----+-----+------+-----+------+-----+
¦Роение на ¦ - ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ d ¦ - ¦ - ¦ - ¦ d ¦ - ¦
¦агаре ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+--------------+-----+------+------+----+----+----+----+-----+------+-----+------+-----+
¦Индофенолокси-¦ + ¦ + ¦ + ¦ + ¦ + ¦ + ¦ + ¦ + ¦ - ¦ + ¦ + ¦ + ¦
¦даза ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+--------------+-----+------+------+----+----+----+----+-----+------+-----+------+-----+
¦Образование: ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦газа из глюко-¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦
¦зы ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+--------------+-----+------+------+----+----+----+----+-----+------+-----+------+-----+
¦индола ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦+(-)¦ + ¦ + ¦ +(-) ¦ + ¦ + ¦ + ¦
+--------------+-----+------+------+----+----+----+----+-----+------+-----+------+-----+
¦ацетилметил- ¦ +(-)¦ + ¦ +/- ¦ + ¦ - ¦ - ¦ d ¦ - ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦
¦карбинола ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+--------------+-----+------+------+----+----+----+----+-----+------+-----+------+-----+
¦Ферментация: ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦лактозы ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ +(-) ¦ -(+)¦ - ¦ d ¦
+--------------+-----+------+------+----+----+----+----+-----+------+-----+------+-----+
¦арабинозы ¦ - ¦ - ¦ + ¦ - ¦ + ¦ + ¦ - ¦ + ¦ - ¦ -(+)¦ +/- ¦ - ¦
+--------------+-----+------+------+----+----+----+----+-----+------+-----+------+-----+
¦сахарозы ¦ + ¦ + ¦ + ¦ - ¦ + ¦ + ¦ d ¦ - ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦
+--------------+-----+------+------+----+----+----+----+-----+------+-----+------+-----+
¦целлобиозы ¦ - ¦ - ¦ + ¦ - ¦-(+)¦-(+)¦ d ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦
+--------------+-----+------+------+----+----+----+----+-----+------+-----+------+-----+
¦маннита ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦ + ¦ + ¦ d ¦ - ¦ + ¦ + ¦ + ¦ +(-)¦
+--------------+-----+------+------+----+----+----+----+-----+------+-----+------+-----+
¦салицина ¦ - ¦ - ¦ + ¦ - ¦+/- ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦
+--------------+-----+------+------+----+----+----+----+-----+------+-----+------+-----+
¦Аргининдигид- ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦ -(+) ¦ - ¦ - ¦ - ¦
¦ролаза ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+--------------+-----+------+------+----+----+----+----+-----+------+-----+------+-----+
¦Лизиндекарбо- ¦ + ¦ + ¦ + ¦+(-)¦ - ¦ - ¦ + ¦ - ¦ +(-) ¦ + ¦ + ¦ + ¦
¦силаза ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+--------------+-----+------+------+----+----+----+----+-----+------+-----+------+-----+
¦Орнитиндекар- ¦ + ¦ d ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦ + ¦ + ¦
¦боксилаза ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+--------------+-----+------+------+----+----+----+----+-----+------+-----+------+-----+
¦бета-галакто- ¦ + ¦ - ¦ +/- ¦ - ¦ d ¦ d ¦ - ¦ - ¦ d ¦ + ¦ - ¦ d ¦
¦зидаза ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+--------------+-----+------+------+----+----+----+----+-----+------+-----+------+-----+
¦Нитратредукта-¦ + ¦ + ¦ + ¦ + ¦ + ¦ + ¦ + ¦ + ¦ - ¦ + ¦ + ¦ + ¦
¦за ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+--------------+-----+------+------+----+----+----+----+-----+------+-----+------+-----+
¦Амилаза ¦ + ¦ + ¦ + ¦ X ¦ + ¦ d ¦ + ¦ X ¦ + ¦ - ¦ + ¦ + ¦
+--------------+-----+------+------+----+----+----

ОРГАНИЗАЦИЯ И ПРОВЕДЕНИЕ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА В ПРИРОДНЫХ ОЧАГАХ ЧУМЫ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУ 3.1.1098-02 (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 15.01.2002)  »
Постановления и Указы »
Читайте также