МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОМУ ИССЛЕДОВАНИЮ ПОЧВЫ (утв. Минздравом СССР 19.02.1981 n 2293-81)


Утверждаю
Заместитель Главного
государственного
санитарного врача СССР
В.Е.КОВШИЛО
19 февраля 1981 г. N 2293-81
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО САНИТАРНО - МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОМУ
ИССЛЕДОВАНИЮ ПОЧВЫ
В подготовке дополнений к Методическим указаниям принимали участие: Г.А. Багдасарьян, Ю.Г. Талаева, А.Ф. Перцовская, Г.П. Кашкарова, Т.В. Доскина, Е.В. Филимонова (Институт общей и коммунальной гигиены им. А.Н. Сысина АМН СССР), Г.В. Меренюк, А.И. Кречун (Молдавский НИИ гигиены и эпидемиологии), Е.М. Юровская (Киевский НИИ общей и коммунальной гигиены им. А.Н. Марзеева).
Настоящие Методические указания по санитарно - микробиологическому исследованию почвы являются дополнением к Методическим указаниям, выпущенным МЗ СССР в 1977 г. Последние сыграли положительную роль в развитии работ по санитарно - микробиологическому исследованию почв, в частности, способствовали усилению контроля за санитарным состоянием почвы, явились методической основой для широкого фронта работ по гигиеническому нормированию химических веществ в почве. Содержащиеся в них методы прошли широкую практическую апробацию в самых различных учреждениях страны, хорошо зарекомендовали себя и рекомендуются для дальнейшего использования в соответствии с требованиями указаний 1977 г. Вместе с тем, проведенные за 1976 - 1980 гг. экспериментальные и натурные методические разработки ряда авторов позволили предложить с целью дальнейшего совершенствования методических указаний, в виде дополнений, ряд методов по их основным разделам.
IV. САНИТАРНО - БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЧВЫ
IV.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ
ПОКАЗАТЕЛЕЙ, ХАРАКТЕРИЗУЮЩИХ ФЕКАЛЬНОЕ
ЗАГРЯЗНЕНИЕ ПОЧВЫ
Определение количества энтерококков в почве
Количество энтерококков в почве может считаться наряду с определением БГКП показателем фекального загрязнения. На основе многократных исследований можно судить о поведении энтерококков в почве, а следовательно характеризовать процесс самоочищения почвы от фекального загрязнения. Рекомендуются для определения энтерококков в почве следующие три метода: 1) титрационный; 2) прямой поверхностный посев; 3) капельный метод.
Первоначальные этапы определения энтерококков в почве такие как отбор проб почвы, хранение и подготовка почвы к анализу, приготовление почвенной суспензии, предварительная обработка почвы, приготовление децимальных разведений - будут одинаковыми, независимо от того, какой будет применен в дальнейшем метод: прямой посев, титрационный или капельный.
Методы обнаружения энтерококков в почве
Отбор проб почвы для обнаружения энтерококков, подготовка почвы к анализу и приготовление почвенной суспензии осуществляется в соответствии с требованиями "Методических указаний по санитарно - микробиологическому анализу почвы", 1977 г., стр. 8 - 13. Отобранные пробы почвы можно хранить в течение 3 суток в холодильнике при +3 - +5 град. C, не допуская при этом подсушивания почвенных проб.
Наиболее эффективным приемом предварительной обработки почвенной суспензии является озвучивание ее низкочастотным ультразвуком (на отечественном диспергаторе УЗДН-1, частота 22 кгц, интенсивность 44 вт/кв. см, сила тока 0,44 А в течение 1 мин. с использованием экспоненциального излучателя). Однако, учитывая недостаточную техническую оснащенность ряда лабораторий, допустима обработка почвенной суспензии путем встряхивания в пробирках или обработка на РТ-2.
При использовании последних двух приемов десорбции, при окончательном расчете энтерококков на 1 г почвы, необходимо ввести поправку, увеличив полученные данные на 37%, т.к. при механической обработке указанное количество энтерококков недоучитывается. Приготовление децимальных разведений почвенной суспензии проводят по стандартной методике.
При анализах почв с предполагаемой невысокой степенью загрязнения посев проводится титрационным методом из децимальных разведений почвенной суспензии в жидкую среду ЩЭС (температура инкубации 37 град. C) с последующим через 24 часа высевом на подтверждающую среду Г.П. Калины. Учет анализов производится через сутки с перерасчетом результатов на 1 г почвы по таблицам НВЧ с учетом влажности.
Сильно загрязненные почвы можно анализировать, проводя посев в жидкую среду ЩЭС, как описано выше или стандартным поверхностным методом на плотную среду Сланца - Бертли или капельным методом <*>. В дальнейшем также делают перерасчет количества определяемых энтерококков на 1 г почвы с учетом влажности и определяют среднюю ошибку опытов.
--------------------------------
<*> Описание приводится в следующем разделе.
Капельный метод посева
Для учета в загрязненных почвах бактерий группы кишечных палочек, энтерококков <*>, общей численности микроорганизмов, споровых бактерий и актиномицетов рекомендуется использование капельного метода посева в упрощенной модификации. Данная методика удобна в полевых экспедиционных условиях, а также при проведении опытов по установлению гигиенических нормативов химических веществ в почве.
--------------------------------
<*> Рекомендуется для оценки фекального загрязнения и для характеристики самоочищения почвы от органических и химических загрязнений.
На поверхность плотной, хорошо высушенной соответствующей среды в чашки Петри наносят микропипеткой по 6 - 10 капель (0,01 мл) из децимальных разведений почвенной суспензии, прошедшей предварительную подготовку. Некоторое время посевы выдерживают на столе, до подсыхания капель, а затем помещают в термостат крышкой вверх. При работе этим методом нужно строго соблюдать режим подсушивания плотных сред в чашках Петри: подсушивание проводят не менее 1 часа при 60 - 70 град. или 1 сутки при комнатной температуре (18 - 20 град. C) до получения "муаровой пленки".
IV.3. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЛИЯНИЯ ХИМИЧЕСКИХ
ВЕЩЕСТВ НА МИКРООРГАНИЗМЫ
Ускоренный культурально - морфологический метод
установления влияния химических веществ
на микроорганизмы
Сущность метода заключается в наблюдении под микроскопом с фазовым контрастом за ростом и размножением чистых культур микроорганизмов на специально приготовленных агаровых пластинках. Питательные среды, соответствующие для изучаемых видов микроорганизмов, расплавляют и разливают в стерильные пробирки по 10 мл. Расчет рабочих концентраций химических веществ производится следующим образом: не больше 1 мл раствора на 10 мл питательной среды. Одна пробирка каждой серии является контрольной - без химических соединений. После внесения химических веществ все пробирки ставят на водяную баню, для поддержания температуры в пределах 50 - 70 град. C. Чистые предметные стекла прожигают над пламенем горелки, затем на них из пробирок наносят тонкий слой (0,5 - 1 мм) питательной среды. Параллельно, на покровное стекло пастеровской пипеткой наносится небольшая капля суспензии клеток тест - микроорганизма определенной концентрации (для энтеробактерий оптимальная концентрация 200 млн./мл, для дрожжей - 50 млн./мл). Покровное стекло с нанесенной каплей бактериальной взвеси переворачивается и опускается на поверхность тонкого слоя агара. Капля под покровным стеклом растекается на всю его площадь. Результаты проведенных опытов показали, что для получения ответа на статистически достоверном уровне достаточно просмотреть один препарат при подсчете не менее 100 микроколоний и единичных клеток. Наблюдение под микроскопом производится после инкубировання в термостате в течение времени, необходимого для каждого вида микроорганизмов и охлаждения их в холодильнике при температуре 6 - 10 град. C в течение 10 - 15 мин. Из термостата вынимают все слайды (опытные и контрольные) одновременно. Просмотр проводят по диагонали препарата с увеличением 40x7. При таком увеличении в поле зрения попадает 20 - 25 клеток, которые легко поддаются учету.
Разработаны критерии учета антибактериальных свойств химических веществ. К ним относятся: 1) процент жизнеспособных клеток; 2) интенсивность размножения - показывающая, с какой скоростью делится популяция за определенный промежуток времени; 3) длительность лаг - фазы; 4) морфологические изменения отдельных клеток и микроколоний.
Показатель жизнеспособности - это удельный вес размножившихся клеток микроорганизмов опытных серий (с токсическими соединениями) по сравнению с контролем в аналогичных условиях без внесения изучаемого соединения. Для получения результатов с точностью на уровне 96% необходимо в каждом препарате просмотреть не менее 400 микроколоний и единичных клеток. Время инкубации определяется опытным путем для каждого вида микроорганизмов. Для ряда видов микроорганизмов время инкубации установлено, а именно: для микроорганизмов кишечной группы - 3 часа; Cl. perfringens - 4 часа; Micrococcus - 3,5 - 5 часов; Rh. gracilis - 7 часов.
Целесообразно, на основании показателя жизнеспособности, определять процент ингибирования, который высчитывается вычитанием от 100 процента жизнеспособности.
Интенсивность размножения является вторым важным показателем влияния токсических соединений на микроорганизмы и определяется следующим образом. После определения первого показателя (жизнеспособность или процент ингибиции) в нескольких полях зрения подсчитывается общее количество клеток во всех микроколониях контрольных и опытных препаратов. Подсчету подлежат и отдельные неразмножавшиеся клетки. Общее количество подсчитываемых отдельных клеток и микроколоний должно быть не менее 100. После, на основании получаемых величин, высчитывается степень подавления или стимуляции выражаемой в процентах по сравнению с контролем. Для этого в контроле и опытных препаратах определяется среднее количество клеток в одной микроколонии. Среднее количество клеток в микроколониях контрольного препарата принимается за 100%.
Одновременно, без дополнительных опытов, на тех же препаратах, можно определить и другой показатель - морфологические изменения микроорганизмов под действием токсических веществ и соединений. В контрольных препаратах отдельные клетки и клетки в микроколониях располагаются в определенном, характерном для каждого вида, порядке, в одной полости, имеют четкое очертание. При выращивании тест - микроорганизмов на питательных средах, содержащих токсическое соединение, наблюдаются морфологические изменения как отдельных клеток, так и микроколоний.
Культурально - морфологическим методом определяется еще один показатель антибактериального действия химических веществ на микроорганизмы - лаг - фаза. Для определения длительности лаг - фазы готовится не один, а несколько препаратов (5 - 6 и более) контроля в каждой концентрации изучаемого химического соединения. Это необходимо для того, чтобы просмотреть контрольный и опытные препараты в динамике - через определенные промежутки времени инкубации. Для этого, с учетом лаг - фазы каждого вида микроорганизма, определяют периодичность просмотра препаратов. Например, если лаг - фаза микроорганизмов находится в пределах 1 часа, то целесообразно препараты просматривать каждые 10 - 15 минут, если 2 - 3 часа и более - каждые 30 минут или 1 час. Общее время наблюдения не должно превышать срок наблюдения при определении первого показателя - жизнеспособности.
Длительность лаг - фазы равна времени от начала инкубации до появления 1 - 3 микроколоний, состоящих из 4 и более клеток и выражается в часах и минутах. Общим требованием, при определении этого показателя, является просмотр всех препаратов (контрольных и опытных) через равные промежутки времени. Для этого, если невозможно их учесть в течение нескольких минут, препараты помещают в холодильник, чтобы прекратить размножение популяции микроорганизмов.
Результаты выражаются в абсолютных (время лаг - фазы в минутах) или относительных (процент удлинения или сокращения лаг - фазы микроорганизмов под действием токсических веществ по сравнению с контролем) показателях.
Экспрессные методы по изучению влияния
химических веществ на микроорганизмы
Для получения в короткие сроки данных о действии химических веществ на микроорганизмы могут использоваться методы определения дыхания, ферментативной активности и показатели начальных этапов роста микроорганизмов. Эти методы позволяют сократить время исследований до нескольких часов.
Определение дыхания микроорганизмов
Исследование проводят в аппарате Варбурга. В пробирки с соответствующей питательной средой, содержащей заданные концентрации изучаемого вещества, вносят тест - микроорганизм. Действие вещества оценивают по разности выделяемого углекислого газа в контроле и опыте.
Определение дегидрогеназной активности микроорганизмов
Определение основано на способности ферментов микроорганизмов - дегидрогеназ восстанавливать за счет дегидрирования субстрата бесцветный трифенилтетразолийхлорид (ТТХ) до формазана (трифенилформазана), имеющего темно - красный цвет. Дегидрогеназы высоко чувствительны к действию биологических ядов, в присутствии которых их активность снижается. Это позволяет путем сравнения количества восстановленного дегидрогеназами микроорганизмов ТТХ в опытах и контроле оценить степень токсичности исследуемого вещества.
Ход определения. Готовят в физиологическом растворе густую суспензию тест - микроорганизмов из суточной культуры на скошенном агаре. Бактериальные клетки осаждают центрифугированием при 4000 об./мин. в течение 10 мин. (Экспозиция установлена для кишечных палочек и сибиреязвенных бацилл.) Надосадочную жидкость сливают, а клетки отмывают от посторонних примесей 3 - 4 раза водопроводной водой или физраствором при той же скорости и времени центрифугирования. Из отмытых клеток готовят стандартную суспензию в физрастворе с постоянной плотностью, соответствующей показанию ФЭК 0,32 - 0,34. Плотность суспензии определяют на ФЭКе в кюветах 5 мм, при зеленом светофильтре.
В химически чистые сухие пробирки вносят в указанной последовательности следующие растворы: 1,2 мл 1/15 Na2HPO4, 0,5 мл 0,1 М глюкозы (субстрат для дегидрирования), 0,1 мл 0,1 М MgSO4, 0,2 мл 0,5% трифенилтетразолийхлорида (ТТХ), 1 мл бактериальной суспензии и исследуемое вещество в количестве, создающем необходимую его концентрацию в пересчете на 1 л. Общий объем реакционной смеси должен быть равен 3 мл. Смесь инкубируют в термостате при 37 град. C в течение 2 часов до появления окраски формазана.
Для извлечения формазана клетки разрушают ледяной уксусной кислотой, которую добавляют по 3 мл в каждую пробирку. Из реакционной смеси формазан экстрагируют толуолом (3 мл в каждую пробирку). Для полного извлечения формазана из реакционной смеси пробирки несколько раз встряхивают и отстаивают. На полноту извлечения формазана указывает обесцвечивание реакционной смеси. Формазан очень осторожно, с помощью пастеровской пипетки, переносят в кюветы для колориметрирования. Колориметрируют в кюветах 3 мл при сине - зеленом светофильтре (с фильтром 490 нм). Качество образованного

УКАЗ Президиума ВС СССР от 19.02.1981 n 3942-x О ПОРЯДКЕ ВВЕДЕНИЯ В ДЕЙСТВИЕ ОСНОВ ЗАКОНОДАТЕЛЬСТВА СОЮЗА ССР И СОЮЗНЫХ РЕСПУБЛИК ОБ АДМИНИСТРАТИВНЫХ ПРАВОНАРУШЕНИЯХ  »
Документы СССР »
Читайте также