"Определение массовой концентрации формальдегида, ацетальдегида, пропионового альдегида, масляного альдегида и ацетона в пробах мочи методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания. МУК 4.1.2110-06" (утв. Роспотребнадзором 09.08.2006)

от альдегидов и кетонов этиловом спирте 1 ч в присутствии каталитических количеств хлористоводородной кислоты. Выпавший в осадок 2,4-динитрофенилгидразон соответствующего альдегида (или ацетона) отфильтровывают и перекристаллизовывают из этанола до постоянной температуры плавления.
7.4. Подготовка хроматографической колонки
Колонку устанавливают на хроматограф и подают элюирующую жидкость, подготовленную в соответствии с п. 7.3.2, со скоростью 100 куб. мм/мин. до установления равновесия колонки, которое определяют по стабильности нулевой линии детектора.
7.5. Установление градуировочной характеристики
7.5.1. Строят две зависимости площади хроматографического пика от концентрации альдегидов и ацетона в крови в диапазонах 0,001 - 0,010 мкг/куб. см и 0,01 - 0,10 мкг/куб. см - для альдегидов, 0,01 - 0,10 мкг/куб. см и 0,1 - 2,0 мкг/см - для ацетона. Градуировочные характеристики устанавливают по пяти сериям растворов для градуировки. Каждую серию, состоящую из пяти растворов, готовят из растворов А и В (см. п. 7.3.5).
7.5.2. Для приготовления градуировочных смесей собирается суммарная проба мочи объемом не менее 1,5 куб. дм (от нескольких человек). В соответствии с п. 8 проводят анализ пробы мочи на содержание альдегидов и ацетона. При наличии анализируемых веществ в холостой пробе вычитают их фоновое содержание при построении калибровки.
7.5.3. Растворы для установления градуировочных характеристик готовят в мерных колбах вместимостью 50 куб. см. Для этого в каждую колбу вносят растворы А и В в соответствии с табл. 1 и 2, доводят объем до метки мочой и перемешивают. Анализируют свежеприготовленные растворы.
Таблица 1
РАСТВОРЫ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ ГРАДУИРОВОЧНОЙ ХАРАКТЕРИСТИКИ
ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ В МОЧЕ АЛЬДЕГИДОВ В ДИАПАЗОНЕ КОНЦЕНТРАЦИЙ
0,001 - 0,010 МКГ/КУБ. СМ И АЦЕТОНА В ДИАПАЗОНЕ КОНЦЕНТРАЦИЙ
0,01 - 0,10 МКГ/КУБ. СМ
-------------------------------------------T------T-----T-----T-----T-----¬
¦Номер раствора ¦1 ¦2 ¦3 ¦4 ¦5 ¦
+------------------------------------------+------+-----+-----+-----+-----+
¦Объем раствора А, куб. см ¦0,0025¦0,005¦0,010¦0,015¦0,025¦
+------------------------------------------+------+-----+-----+-----+-----+
¦Массовая концентрация формальдегида, ¦0,001 ¦0,002¦0,004¦0,006¦0,01 ¦
¦мкг/куб. см ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+------------------------------------------+------+-----+-----+-----+-----+
¦Массовая концентрация ацетальдегида, ¦0,001 ¦0,002¦0,004¦0,006¦0,01 ¦
¦мкг/куб. см ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+------------------------------------------+------+-----+-----+-----+-----+
¦Массовая концентрация пропионового ¦0,001 ¦0,002¦0,004¦0,006¦0,01 ¦
¦альдегида, мкг/куб. см ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+------------------------------------------+------+-----+-----+-----+-----+
¦Массовая концентрация масляного альдегида,¦0,001 ¦0,002¦0,004¦0,006¦0,01 ¦
¦мкг/куб. см ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+------------------------------------------+------+-----+-----+-----+-----+
¦Объем раствора В, куб. см ¦0,025 ¦0,050¦0,100¦0,150¦0,250¦
+------------------------------------------+------+-----+-----+-----+-----+
¦Массовая концентрация ацетона, мкг/куб. см¦0,01 ¦0,02 ¦0,04 ¦0,06 ¦0,10 ¦
L------------------------------------------+------+-----+-----+-----+------
Таблица 2
РАСТВОРЫ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ ГРАДУИРОВОЧНОЙ ХАРАКТЕРИСТИКИ
ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ В МОЧЕ АЛЬДЕГИДОВ В ДИАПАЗОНЕ КОНЦЕНТРАЦИЙ
0,01 - 0,10 МКГ/КУБ. СМ И АЦЕТОНА В ДИАПАЗОНЕ КОНЦЕНТРАЦИЙ
0,1 - 2,0 МКГ/КУБ. СМ
--------------------------------------------T-----T-----T-----T-----T-----¬
¦Номер раствора ¦1 ¦2 ¦3 ¦4 ¦5 ¦
+-------------------------------------------+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Объем раствора А, куб. см ¦0,025¦0,050¦0,100¦0,150¦0,250¦
+-------------------------------------------+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Массовая концентрация формальдегида, ¦0,01 ¦0,02 ¦0,04 ¦0,06 ¦0,10 ¦
¦мкг/куб. см ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------------------------------------+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Массовая концентрация ацетальдегида, ¦0,01 ¦0,02 ¦0,04 ¦0,06 ¦0,10 ¦
¦мкг/куб. см ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------------------------------------+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Массовая концентрация пропионового ¦0,01 ¦0,02 ¦0,04 ¦0,06 ¦0,10 ¦
¦альдегида, мкг/куб. см ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------------------------------------+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Массовая концентрация масляного альдегида, ¦0,01 ¦0,02 ¦0,04 ¦0,06 ¦0,10 ¦
¦мкг/куб. см ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------------------------------------+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Объем раствора В, куб. см ¦0,25 ¦0,50 ¦1,25 ¦2,50 ¦5,00 ¦
+-------------------------------------------+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Массовая концентрация ацетона, мкг/куб. см ¦0,1 ¦0,2 ¦0,5 ¦1,0 ¦1,98 ¦
L-------------------------------------------+-----+-----+-----+-----+------
В делительную воронку помещают 50 куб. см градуировочного раствора, добавляют 2,5 куб. см 0,2%-го раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М хлористоводородной кислоте, 2 капли концентрированной хлористоводородной кислоты, 5 куб. см гексана и экстрагируют 15 мин. После расслоения гексана и мочи верхний слой (гексановый) переносят в центрифужную пробирку с завинчивающейся крышкой и центрифугируют 20 мин. со скоростью 1500 об./мин., затем 2 куб. см гексана переносят в бюксу и высушивают в потоке воздуха. Высушенный остаток растворяют в 0,5 куб. см элюента и аликвотную часть (10 куб. мм) анализируют в условиях:
элюент - (ацетонитрил:вода = 60:40) + 2,5% уксусной кислоты + 1% диэтиламина;
колонка 80 х 2 мм, заполнена Диасорбом С
16
скорость движения элюента 100 куб. мм/мин.;
длина волны УФ-детектора 358 нм;
время удерживания:
2,4-динитрофенилгидразона формальдегида 3,10 мин.;
2,4-динитрофенилгидразона ацетальдегида 3,95 мин.;
2,4-динитрофенилгидразона ацетона 4,70 мин.;
2,4-динитрофенилгидразона пропаналя 5,04 мин.;
2,4-динитрофенилгидразона бутаналя 7,95 мин.
Градуировочный коэффициент рассчитывают по формуле:
n
SUM = С / S
i=1 i i
К = -------------,
n
где:
С - концентрация вещества в градуировочной смеси, мкг/куб. см;
i
S - среднее значение пяти измерений площади пика i-й концентрации,
i
единицы оптической плотности (е.о.п.);
n - количество градуировочных смесей (n = 5).
7.6. Отбор проб
Для отбора проб мочи используют чистую стеклянную посуду объемом 100 куб. см с плотно закрывающейся крышкой. Срок хранения пробы в холодильнике - 12 ч.
8. Выполнение измерений
Проводят два параллельных измерения образца мочи. В делительную воронку вместимостью 250 куб. см помещают 50,0 куб. см мочи, добавляют 2,5 куб. см 0,2%-го раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М хлористоводородной кислоте, 2 капли концентрированной хлористоводородной кислоты, 5 куб. см гексана и экстрагируют 15 мин. После отстаивания верхний слой (гексановый) переносят в центрифужную пробирку с завинчивающейся крышкой и центрифугируют 20 мин. со скоростью 1500 об./мин. После расслоения жидкостей 2 куб. см гексанового экстракта переносят в бюксу и высушивают в потоке воздуха. Высушенный остаток растворяют в 0,5 куб. см элюента, вводят в хроматограф аликвотную часть (10 куб. мм) и анализируют в условиях, указанных в п. 7.5.
Идентификацию хроматографических пиков 2,4-динитрофенилгидразонов формальдегида, ацетальдегида, пропионового и масляного альдегидов и ацетона проводят путем сравнения времен удерживания хроматографических пиков в анализируемой пробе и в растворах 2,4-динитрофенилгидразонов альдегидов и ацетона, полученных согласно п. 7.3.6.
9. Вычисление результатов измерения
Концентрацию альдегидов и ацетона в моче (мкг/куб. см) вычисляют по формуле:
Х = S х К,
i
где:
Х - концентрация вещества в анализируемой пробе, мкг/куб. см;
S - площадь пика соответствующего 2,4-динитрофенилгидразона альдегида
i
(или ацетона) в анализируемой пробе, е.о.п.;
К - градуировочный коэффициент.
_
За результат измерения Х принимают среднее арифметическое двух
параллельных измерений Х , Х , расхождение между которыми не должно
1 2
превышать значения предела повторяемости r (табл. 3).
n
_
Результат измерения представляют в виде (Х +/- ДЕЛЬТА), мкг/куб. см,
где ДЕЛЬТА - характеристика погрешности, мкг/куб. см, при Р = 0,95, равная:
_
дельта х Х
ДЕЛЬТА = ----------,
100
где дельта - относительное значение характеристики погрешности, %.
10. Внутренний оперативный контроль результатов измерений
Внутренний контроль качества (ВКК) результатов измерений - повторяемость, внутрилабораторная прецизионность (воспроизводимость), точность - осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве результатов измерений и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению в соответствии с нормативным документом МИ 2335-2003 "ГСОЕИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа".
Методика выполнения измерений обеспечивает получение результатов измерений с нормативами, не превышающими значений, приведенных в табл. 3 и 4.
Таблица 3
ЗНАЧЕНИЯ ПРЕДЕЛОВ ПОВТОРЯЕМОСТИ И ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ
ПРИ ДОВЕРИТЕЛЬНОЙ ВЕРОЯТНОСТИ Р = 0,95
----------------------T--------------------T------------------------------¬
¦ Наименование ¦Предел повторяемости¦ Предел внутрилабораторной ¦
¦ определяемого ¦ (относительное ¦ воспроизводимости ¦
¦ компонента и ¦ значение ¦ (относительное значение ¦
¦ диапазон измерений, ¦ допускаемого ¦допускаемого расхождения между¦
¦ мкг/куб. см ¦ расхождения между ¦двумя результатами измерений, ¦
¦ ¦ двумя результатами ¦ полученными в одной ¦
¦ ¦ параллельных ¦ лаборатории, но в разных ¦
¦ ¦определений), r , % ¦ условиях), R , % ¦
¦ ¦ n ¦ _ ¦
¦ ¦ ¦ Хl ¦
+---------------------+--------------------+------------------------------+
¦Формальдегид, ¦26,8 ¦27,2 ¦
¦от 0,001 до 0,1 вкл. ¦ ¦ ¦
+---------------------+--------------------+------------------------------+
¦Ацетальдегид, ¦16,8 ¦24,7 ¦
¦от 0,001 до 0,1 вкл. ¦ ¦ ¦
+---------------------+--------------------+------------------------------+
¦Пропионовый альдегид,¦24,5 ¦26,1 ¦
¦от 0,001 до 0,1 вкл. ¦ ¦ ¦
+---------------------+--------------------+------------------------------+
¦Масляный альдегид, ¦23,7 ¦25,9 ¦
¦от 0,001 до 0,1 вкл. ¦ ¦ ¦
+---------------------+--------------------+------------------------------+
¦Ацетон, ¦24,9 ¦26,8 ¦
¦от 0,01 до 2,0 вкл. ¦ ¦ ¦
L---------------------+--------------------+-------------------------------
Таблица 4
ДИАПАЗОН ИЗМЕРЕНИЙ, ЗНАЧЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ТОЧНОСТИ,
ПОВТОРЯЕМОСТИ, ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ
----------------------T-----------------T-----------------T---------------¬
¦ Наименование ¦Показатель ¦Показатель ¦ Показатель ¦
¦ определяемого ¦повторяемости ¦воспроизводимости¦ точности ¦
¦ компонента и ¦(относительное ¦(относительное ¦ (границы ¦
¦ диапазон ¦среднеквадрати- ¦среднеквадрати- ¦ относительной ¦
¦ измерений, мг/куб. ¦ческое отклонение¦ческое отклонение¦погрешности при¦
¦ дм (мкг/куб. см) ¦повторяемости), ¦воспроизводимо- ¦ вероятности ¦
¦ ¦сигма , % ¦сти), сигма , % ¦ Р = 0,95), ¦
¦ ¦ r ¦ R ¦ +/- дельта, % ¦
+---------------------+-----------------+-----------------+---------------+
¦Формальдегид, ¦9,9 ¦10,7 ¦26,0 ¦
¦от 0,001 до 2,0 вкл. ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------+-----------------+-----------------+---------------+
¦Ацетальдегид, ¦7,1 ¦9,3 ¦20,0 ¦
¦от 0,001 до 0,1 вкл. ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------+-----------------+-----------------+---------------+
¦Пропионовый альдегид,¦7,6 ¦13,3 ¦25,0 ¦
¦от 0,001 до 0,1 вкл. ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------+-----------------+-----------------+---------------+
¦Масляный альдегид, ¦8,5 ¦10,6 ¦19,0 ¦