Определение содержания химических элементов в диагностируемых биосубстратах, поливитаминных препаратах с микроэлементами, в биологически активных добавках к пище и в сырье для их изготовления методом атомной эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной аргоновой плазмой. методические указания. мук 4.1.1482-03 (утв. главным государственным санитарным врачом рф 29.06.2003)
препарирования, удаления крови
взвешиваются с точностью до 5 мг и
помещаются в лабораторную пластиковую или
стеклянную посуду, обеспечивающую
герметичность хранения. Масса образца
ткани от 0,1 г (минимальная, определение
макроэлементов - железо, цинк, медь) до 3 - 5 г
(определение содержания более 20 химических
элементов). Допускается хранение в
холодильнике при температуре 0 - 4 °С до 7
суток или в морозильной камере при
температуре -18 °С или высушивание и
лиофилизация образцов для длительного
хранения.
Пробы конкрементов - зубов,
фрагментов костной ткани - особых условий
хранения не требуют, помещаются в
герметичную упаковку из лабораторного
пластика.
Препараты аминокислот,
поливитаминные препараты с
микроэлементами, биологически активные
добавки к пище и сырье для их изготовления
поступают для исследования в упаковке
производителя. Необходимая для
исследования минимальная масса твердых
препаратов составляет 10 г, жидких - 100 г.
10.
Разложение проб биосубстратов
Волосы.
Ногти. Другие твердые образцы. Открытое
разложение. На
аналитических весах
берут навеску образца массой 0,01 - 0,10 г.
TM
Навеску помещают во фторопластовый
цилиндр (PTFE, Viton ,
TM
Teflon , PFA),
приливают 0,2 - 1,0 мл концентрированной
азотной
кислоты, накрывают защитной
лабораторной пленкой и помещают в
термоблок, разогретый до 115 °C, выдерживают в
течение 0,5 - 1,0 ч
до полного растворения
пробы. Растворенный образец
количественно
переносят в мерную
полипропиленовую пробирку, троекратно
смывая со
стенок цилиндра, и доводят
деионизованной водой до 10 мл.
Герметично закрывают защитной
лабораторной пленкой, перемешивают и
передают на анализ.
Жидкие образцы.
Открытое разложение. Навеску
анализируемого
объекта 0,1 - 0,5 г (0,1 - 0,5 мл)
берут на аналитических весах во
TM TM
фторопластовые
цилиндры (PTFE, Viton , Teflon , PFA), определяя
массу навески по разнице массы пробирки до
и после взятия навески.
В цилиндр
приливают 0,3 - 1,0 мл концентрированной
азотной
кислоты, накрывают
лабораторной пленкой и помещают в
термоблок,
разогретый до 115 °С.
Выдерживают в термоблоке в течение 0,5 - 1,0
ч до гомогенизации пробы и далее действуют,
как описано в п. 10.
При работе с
гомогенными водными средами, такими как
моча (не содержащая осадка), лимфа, плазма и
даже цельная кровь, допускается простое
разбавление образца 2 - 3%-ной азотной
кислотой непосредственно перед анализом.
Для этого к навеске образца в мерной
пробирке приливается 5 - 7 мл деионизованной
воды, затем 0,3 - 0,5 мл концентрированной
азотной кислоты и проба доводится до 10 - 15 мл
деионизованной водой. В этом случае не
рекомендуется уменьшать фактор
разбавления пробы ниже чем 1:100 во избежание
осаждения белков, а также для компенсации
высокой вязкости образцов и склонности к
пенообразованию. Пробы, растворенные таким
способом, не рекомендуется хранить до
анализа долгое время (свыше суток).
Микроволновая пробоподготовка. Навеску
образца по п. п. 10, 11 помещают во
фторопластовый вкладыш и добавляют 5 мл
азотной кислоты. Автоклав с пробой во
вкладыше помещают в микроволновую печь и
разлагают пробу, используя программу
разложения, рекомендованную
производителем печи. В общем случае для
мягких тканей, волос и жидкостей можно
применять следующий режим нагрева: подъем
температуры до 200 °С в течение 5 мин.,
выдерживание в течение 5 мин. при 200 °С,
охлаждение до 45 °С. Охлажденный автоклав
встряхивают для перемешивания содержимого
и приоткрывают крышку для уравновешивания
давления. Качественно разложенная проба
после отгона окислов азота должна
представлять собой бесцветный или
желтоватый прозрачный раствор без
нерастворившихся частиц на дне и на стенках
вкладыша. Растворенную пробу количественно
переносят в пробирку объемом 15 мл,
троекратно встряхивая вкладыш с крышкой с 1
мл деионизованной воды и перенося каждый
смыв в пробирку, доводят объем до 10 мл
деионизованной водой, закрывают и
перемешивают. Автоматическим дозатором со
сменным наконечником отбирают аликвотную
часть 1 мл и доводят до 10 мл 0,5%-ной азотной
кислотой, закрывают защитной лабораторной
пленкой, передают на анализ. Данные об
объеме аликвотной части и объеме
разведения вводят в программное
обеспечение спектрометра вместе с
названием и навеской образца.
Допускается непосредственный отбор
аликвотной части объемом 0,1 - 0,5 мл из
разложенной пробы в автоклаве. Чтобы
скомпенсировать при этом погрешность
разбавления, перед разложением в пробу
нужно добавить раствор внутреннего
стандарта (In или Rh), чтобы концентрация
внутреннего стандарта в конечном растворе,
направляемом на анализ, составляла
примерно 10 мкг/л (например, добавить в пробу
100 мкл раствора, содержащего 10 мг/л Rh, затем
из 5 мл разложенной пробы взять аликвотную
часть 0,5 мл и довести до 10 мл). Раствор
внутреннего стандарта необходимо
добавлять во все холостые пробы и в
калибровочные растворы. Заданную
концентрацию внутреннего стандарта (10
мкг/л) в холостых и стандартных растворах
необходимо точно соблюдать.
Раствор
холостой пробы готовят с выполнением всех
указанных выше операций, за исключением
операции взятия навески.
11. Разложение
проб аминокислот,
поливитаминных
препаратов с микроэлементами,
биологически активных добавок к пище
и
сырья для их изготовления
Навеску
измельченной пробы 0,1 - 0,2 г помещают во
фторопластовый цилиндр, приливают 1 мл
концентрированной азотной кислоты,
встряхивают, накрывают лабораторной
пленкой и помещают на 0,5 - 1,0 ч в термоблок с
температурой 115 °С до полного растворения
пробы. Получившийся прозрачный раствор
количественно переносят в мерную
полипропиленовую пробирку, троекратно
смывая со стенок фторопластового цилиндра,
доводят деионизованной водой до 10 мл.
Герметично закрывают защитной
лабораторной пленкой, перемешивают и
передают на анализ. При использовании
микроволновой пробоподготовки действуют
по п. 10.
Раствор холостой пробы готовят с
выполнением всех указанных выше операций,
за исключением операции взятия
навески.
12. Приготовление стандартных
градуировочных растворов
Рабочие
стандартные растворы готовят разбавлением
стандартных опорных многоэлементных
растворов. Опорные стандарты
приготавливают, смешивая определенные
количества одноэлементных стандартных
растворов Perkin-Elmer для атомной спектрометрии
серии Essentials. При этом учитывают матрицы
исходных растворов для исключения потерь
элементов вследствие соосаждения и
сорбции. Пропорции и концентрации
элементов в опорных растворах подбирают
таким образом, чтобы после разбавления в 20 -
50 раз получались концентрации одного
порядка с верхними границами диапазона
содержаний элементов в волосах (Bertram, 1992,
Скальный, 2000), разложенных по стандартной
методике, исходя из навески 0,1 г на 10 мл
конечного раствора. Приготовленные 10 - 50 мл
опорных стандартов сохраняют в
полипропиленовых или полистироловых
контейнерах.
Приготовление рабочих
стандартов состоит в доведении аликвотной
части опорного раствора до требуемого
объема разбавленной азотной кислотой или
деионизованной водой (для водных
растворов). Рассчитанные концентрации
приготовленных растворов рассчитывают и
вводят в память компьютера в файл
программного пакета WinLab32. В готовый рабочий
стандарт добавляют внутренний стандарт -
раствор азотнокислого индия с
концентрацией ~= 1000 мг (In/л), из расчета 100 мкл
на каждые 10 мл стандарта. Рабочие стандарты
сохраняют и расходуют в течение 1 - 5 рабочих
дней. Пример состава рабочих растворов
приведен в Прилож. 1, 2.
13. Подготовка
прибора
Спектрометр подготавливают к
работе в соответствии с руководством
пользователя (инструкцией) по эксплуатации.
Необходимые режимы работы устанавливают в
соответствии с рекомендациями
фирмы-изготовителя. Рекомендуемый режим
проведения измерений приведен в Прилож. 3.
Для конкретного типа прибора оптимальные
режимы могут быть установлены
экспериментально. После запуска прибора
производят проверку технических
характеристик, выполняя тест эквивалентной
фоновой концентрации, тест на
воспроизводимость, тест на предел
обнаружения.
14. Устранение мешающих
влияний
Поправки на влияние фона при
возникновении матричных эффектов и
подавление взаимного влияния определяемых
элементов вследствие спектральных
наложений осуществляют при помощи
программного обеспечения спектрометра в
соответствии с руководством по
эксплуатации спектрометра. Спектральных
наложений избегают выбором наилучших
аналитических длин волн в эмиссионных
спектрах определяемых элементов. Для
устранения влияния линий-интерферентов и
фона плазмы применяют алгоритм
мультиспектральной фильтрации помех и
фона, реализованный в программном
обеспечении WinLab32.
15. Градуировка
спектрометра
Градуировку спектрометра
выполняют перед началом измерений
полностью подготовленных проб, используя
градуировочные растворы при параметрах,
установленных по п. п. 12, 13. Нахождение
градуировочной характеристики, обработка и
хранение результатов градуировки
спектрометра выполняют с использованием
программного обеспечения
спектрометра.
16. Выполнение
измерений
Ввод в спектрометр
подготовленной пробы, измерение атомного
излучения элементов и концентрации
определяемых элементов проводят при
нормальных климатических условиях
испытаний в соответствии с п. 3, с учетом
требований руководства (инструкции) по
эксплуатации спектрометра. Устанавливают
оптимальный режим регистрации спектров и
измерений в соответствии с Прилож. 3.
Интенсивность характеристического
излучения регистрируется
фоточувствительным детектором после
прохождения этого излучения через
монохроматор. Интенсивность и положение
спектральных линий измеряются и
обрабатываются компьютерной системой
спектрометра.
Выбор аналитических
линий. Для измерения используют
спектральные линии элементов, наиболее
предпочтительные по совокупности
характеристик. Важнейшими из них являются
интенсивность, отсутствие спектральных
наложений, отношение сигнал/шум,
достигаемый предел обнаружения,
эквивалентная концентрация фона (ЭКФ). При
отладке методики проводят измерения по 3 - 5
линиям на элемент, затем из них выбирают
наилучшую для постоянной работы. Примеры
выбора оптимальных длин волн и достигаемых
при этом пределов обнаружения приведены в
Прилож. 4.
17. Обработка результатов
измерений
Аналитические сигналы
обрабатывают при помощи программного
обеспечения спектрометра, используя
градуировочные зависимости,
рассчитываемые методом наименьших
квадратов, учет и коррекцию фона, при
необходимости - учет взаимного влияния
измеряемых элементов. Результат
определения на дисплее отвечает среднему
арифметическому из нескольких
параллельных измерений анализируемого
элемента. Обработка результатов измерений
соответствует ГОСТ 8.207. Результаты
измерений выводятся на дисплей,
сохраняются в файле на жестком диске.
Распечатанные результаты оформляют
протоколом (Прилож. 5).
18. Внутренний
оперативный контроль
Внутренний
контроль качества результатов определения
микроэлементов (сходимость,
воспроизводимость, точность) осуществляют
с целью получения оперативной информации о
качестве анализов и принятия при
необходимости оперативных мер по его
повышению. Оперативный контроль качества
осуществляют путем проведения анализа
испытуемых проб и стандартного образца,
химический состав которого не должен
отличаться от состава испытуемой пробы
настолько, чтобы потребовалось изменить
методику проведения анализа.
Периодичность контроля воспроизводимости
результатов анализа определяется
количеством рабочих измерений за
контролируемый период и определяется
планами контроля. В работе участвуют два
аналитика. Образцами для контроля являются
представительные пробы, каждую из которых
анализируют в точном соответствии с
прописью, максимально варьируя условия
проведения анализа: получают два
результата, используя разные наборы мерной
посуды, разные партии реактивов и разные
экземпляры стандартных образцов для
градуировки прибора.
Результат
контроля признается удовлетворительным,
если выполняется условие:
_ _
_
|X - X | <= 0,01D x X,
1 2
где:
_
X -
результат анализа рабочей пробы, мкг/г;
1
_
X - результат анализа этой
же пробы, полученный другим
2
аналитиком с использованием другого
прибора, другой мерной посуды
и другой
партии реактивов, мкг/г;
D - допустимые
расхождения между результатами анализа
одной и
той же пробы, %.
При
превышении норматива оперативного
контроля воспроизводимости эксперимент
повторяют. При повторном превышении
указанного норматива D выясняют причины,
приводящие к неудовлетворительным
результатам работы и контроля, и устраняют
их.
Периодичность контроля
воспроизводимости результатов анализа
определяется количеством рабочих
измерений за контролируемый период и
определяется планами контроля. Используют
технику метода стандартных добавок или, при
наличии стандартных образцов состава,
выполняют их анализ. Рекомендуется
использовать стандартные образцы
человеческих волос, крови, сыворотки, мочи,
тканей и органов животных и растений, а
также аминокислотных и поливитаминных
препаратов с микроэлементами, производимых
агентствами по стандартным образцам (NCCRM -
Китай, NIST - США, IRMM - Объединенная Европа, NIES -
Япония), а также специализированными
фирмами (Bio-Rad, Seronorm, Sigma-Aldrich, Merck и др.).
Метод стандартных добавок. Отбирают две
пробы и к одной из них делают добавку в виде
раствора таким образом, чтобы содержание
определяемого элемента увеличилось по
сравнению с исходным на 50 - 150%. Каждую пробу
анализируют в точном соответствии с
прописью методики и получают результат
анализа исходной рабочей пробы X и рабочей
пробы с добавкой X". Результаты анализа
исходной рабочей пробы X и рабочей пробы с
добавкой X" получают в строго одинаковых
условиях, т.е. их получает один аналитик с
использованием одного набора мерной
посуды, одной партии реактивов и т.д.
Результаты контроля признаются
удовлетворительными, если выполняется
условие:
|X" - X - С| < К ,
Д
где:
К -
норматив оперативного контроля
погрешности, мкг/г;
С - добавка к пробе
в виде раствора с концентрацией, мкг/г.
При внешнем контроле (Р = 0,95) принимают:
_________________
/
2 2
К" = /ДЕЛЬТА + ДЕЛЬТА
,
Д / X" X
