Приказ минздрава рф от 26.11.1998 n 342"об усилении мероприятий по профилактике эпидемического сыпного тифа и борьбе с педикулезом"
(0,025) мл контрольных эритроцитов.
2.
Контроль эритроцитарного диагностикума на
отсутствие спонтанной гемагглютинации: в 2
лунки, содержащие по 0,4 (0,05) мл ФФР, добавляют
по 0,1 (0,025) мл эритроцитарного
диагностикума.
3. Заведомо
положительный контроль: постановка РНГА с
тест - сывороткой к риккетсиям Провачека,
прилагаемой к данной серии эритроцитарного
диагностикума.
Учет результатов
РНГА.
Учет результатов реакции проводят
по наличию или отсутствию агглютинации
эритроцитов. Реакцию считают положительной
(оценивают на "+"), если агглютинировавшие
эритроциты выстилают дно лунки, образуя по
форме перевернутый купол с ровным или
фасеточным краем. Титром исследуемой
сыворотки считают максимальное ее
разведение, которое вызывает четкую
агглютинацию эритроцитарного
диагностикума.
Реакцию считают
отрицательной (оценивают на "-") при оседании
эритроцитов на дно лунки в виде диска или
компактного кольца с четким ровным краем. В
сомнительных случаях реакцию оценивают на
"+/-".
2.1.2. РНГА с препаратом на основе
нативных эритроцитов.
При отсутствии
коммерческого антигенного риккетсиального
эритроцитарного диагностикума РНГА можно
ставить с нативными эритроцитами барана,
предварительно сенсибилизированными
коммерческим антигеном (гаптеном)
риккетсий для реакции гемагглютинации.
Антиген растворяют в физиологическом
растворе (рН=7,0) в соответствии с указаниями
на этикетке ампулы. 4 мл растворенного
антигена смешивают с 0,1 мл осадка отмытых
эритроцитов барана, выдерживают смесь в
течение 1 часа при +37 град. С, встряхивая
каждые 15 минут, затем центрифугируют 10
минут при 2500-3000 об/мин., надосадочную
жидкость отсасывают, а осадок суспендируют
в 10 мл физиологического раствора (рН=7,0),
получая 10 мл 1% взвеси сенсибилизированных
эритроцитов. Такой препарат может
сохраняться в течение нескольких дней при +4
град. С без снижения активности. РНГА в этом
случае ставят на обычном физиологическом
растворе (рН=7,0), в остальном подготовка
ингредиентов, постановка реакции и учет
результатов проводятся точно также, как при
использовании сухого антигенного
риккетсиального эритроцитарного
диагностикума, за исключением первого
разведения исследуемой сыворотки, которое
берется не 1:25, а 1:250.
2.2. Метод
флуоресцирующих антител.
Метод
флуоресцирующих антител (МФА) - экспресс -
метод - сочетает высокую чувствительность
люминесцентного анализа с высокой
специфичностью иммунологического метода.
МФА применяется в лабораторной диагностике
с целью выявления риккетсиальных антигенов
и антител. Этот метод используют в прямой и
непрямой модификации с применением
флуоресцирующих конъюгатов, полученных на
основе иммуноглобулинов специфических
сывороток.
Ингредиенты и
оборудование.
1. Риккетсиальные
корпускулярные антигены (для МФА).
2.
Специфические антириккетсиальные
сыворотки.
3. Люминесцирующие
специфические риккетсиальные сыворотки.
4. Люминесцирующие антивидовые сыворотки к
иммуноглобулинам человека и различного
вида животных.
5. Люминесцирующие
Fab-фрагменты риккетсиальных антител.
6.
Забуференный физиологический раствор рН =
7,2.
7. Спирт 96 град.
8. Ацетон.
9.
Дистиллированная вода.
10. Бычий
альбумин, меченый родамином или Эванс.
11. Люминесцентный микроскоп (МЛ-1, МЛ-2, МЛ-Л,
ЛЮМАМ).
12. Предметные стекла.
13. Чашки
Петри.
14. Емкости для промывания
стекол.
15. Фильтровальная бумага.
2.2.1. Прямой метод флуоресцирующих
антител.
Прямой метод флуоресцирующих
антител (пМФА) используется с целью
выявления риккетсиальных антигенов в
биологических пробах и объектах внешней
среды.
Метод осуществляют следующим
образом. На тщательно вымытые и
обезжиренные предметные стекла делают
тонкие мазки или отпечатки исследуемого
материала. После высыхания мазки фиксируют
этиловым спиртом или ацетоном в течение 30
минут. По мазку восковым карандашом делают
ряд окружностей диаметром 0,5 см, в
зависимости от количества искомых
антигенов, чтобы создать барьер,
препятствующий растеканию люминесцирующей
сыворотки.
На эти поля фиксированных и
высушенных мазков наносят по капле
разведенных флуоресцирующих сывороток
против искомых антигенов (рабочее
разведение указано на ампуле) в смеси с
равным объемом Эванса 0,1% или бычьего
альбумина, меченого родамином (в смеси оба
раствора должны быть в рабочем разведении).
В контрольное поле наносят гетерологичную
флуоресцирующую сыворотку так же в смеси с
бычьим альбумином. Обработку мазков
проводят 30 минут при температуре +37 град. С
во влажной камере (чашка Петри с
увлажненным дном), что предупреждает
высыхание конъюгата. Отмывание мазков от
избытка флуоресцирующей сыворотки
производят в фосфатном буферном растворе
(рН=7,2-7,4) в течение 10 минут. После
ополаскивания дистиллированной водой
препараты высушивают на воздухе и
исследуют в люминесцентном микроскопе.
Учет результатов реакции.
Препараты
исследуют в люминесцентном микроскопе,
объектив 90х, окуляр 10х или 7х. Первичные
светофильтры для МЛ 2-ФС-1-4; СЗС 7-2; БС-8-2,
окулярный или запирающий - 2; для ЛЮМАМ - ФС
1-4; СЗС 21-2, ФС 1-6; окуляр зеленый (т.е. фильтры,
которые обычно
